褪黑素对机插水卷苗植伤修复效应及其机理(2)
2．2 褪黑素对机插水卷苗鲜重的影响 · 7
2．3 褪黑素对机插水卷苗可溶性蛋白含量的影响 · 8
2．4 褪黑素对机插水卷苗内含有毒物质的影响 8
2．4．1 褪黑素对机插水卷苗丙二醛（MDA）和过氧化氢（H2O2）含量的影响 · 8
2．4．2 褪黑素对机插水卷苗超氧阴离子产率的影响 · 9
2．5 褪黑素对机插水卷苗抗氧化酶活性的影响 9
2．5．1褪黑素对机插水卷苗过氧化氢酶（CAT） 、过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶
（SOD）和活性的影响 · 9
2．5．2褪黑素对机插水卷苗谷胱甘肽还原酶（GR）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性
的影响 · 10
3 讨论与结论 11
致谢 12
参考文献 12
水稻是我国最重要的粮食作物，全国 65%以上的人口以稻米为主食，其总产量和播种面积均居我国粮食作物前列[1-2]。 中国水稻机插秧技术已有50多年的研究历史，从1995年全国水稻机插秧面积仅占水稻种植面积的 2.3%，到 2014年的38%，水稻机插秧正持续快速发展。随着社会经济的发展,劳动力成本增加,农村劳动力老龄化现象严重，省工、省力的机械化种植技术逐渐成为当前水稻生产的主要方向[3-7]。 目前我国发展的水稻机械化栽植还在处于初级阶段，尤其是作业水平还和国外有一定的差距。我国大面积推广使用的毯苗机插，主要存在用种量大、机插秧龄弹性小，秧苗素质低、机插质量差、栽后缓苗期长等问题；机械插秧缩短水稻品种生育期，减小品种增产潜力；同时高密度播种会降低秧苗群体透光、透气性，秧苗个体间水、肥竞争增加，降低个体生长量和群体质量。针对当前工厂化育秧秧龄弹性小、成本高、播种量大、广大农民对机插秧积极性不高等问题，完善科学配套农艺措施，创新壮秧培育技术，对稳定水稻种植面积和提高水稻产量具有重要意义。 植物细胞通过长期的进化形成较完整的防御系统，抗氧化酶和抗氧化剂是其重要的组成部分，抗氧化物酶包括过氧化氢酶（CAT） 、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、谷胱甘肽还原酶（GR）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）等[8]。CAT 是含血红素Fe的蛋白质，具有强大的催化功能，专一地作用于 H2O2，使机体内的H2O2不会积蓄中毒，对于减轻活性氧损伤具有重要的意义[9]； SOD 是一种重要的抗氧化剂，能清除自由基（O2+ -），通过把O2+ -转化为H2O2， H2O2再被CAT、POD转化为无害的水，保护暴露于空气的细胞。GR 和APX是植物体内一种重要的抗氧化酶类，其重要的功能是将氧化型谷胱甘肽还原成还原型谷胱甘肽，从而为活性氧的清除提供还原力[10-11]。目前研究发现，褪黑素是广泛存在于高等植物中具有重要生理功能的多效性分子[12-14]。有研究表明，褪黑素通过促进细胞膨大以促进生长，并可以通过诱导中柱鞘细胞产生新的根原基，增加侧生根的长度和数量，促进根系发育[15-16]。此外，褪黑素还具有较强的活性氧清除作用，其较高亲脂亲水性可以穿透胞质和膜质，以此进入细胞核发挥抗氧化作用，同时文护膜脂完整性，保护叶绿素，延缓叶片衰老，增强植物抵御逆境胁迫，外源褪黑素在农作物生产中的应用以及提高作物抗逆性是未来利用褪黑素提高作物产量，改善产品质量的重点研究领域[17-18]。目前褪黑素在水稻生产中的应用较少，不同浓度褪黑素对水稻秧苗的形态及生理生化方面的影响还有待进一步研究。 水稻是我国最重要的粮食作物之一，水稻产量的高低和品质的优劣对保证我国粮食安全和人民生活水平的提高具有重要作用。本文以机插水卷苗为研究对象，基于全自动光照培养箱，在水稻幼苗时期进行人工剪根处理模拟机插水卷苗的植伤，实施不同褪黑素浓度处理下机插水卷苗水培实验，探明褪黑素对机插水卷苗植伤修复的效果，明确褪黑素对机插水卷苗植伤修复的机理，确定加快水卷苗栽后缓苗返青施用褪黑素的最适浓度。 1 材料与方法 1．1 实验材料与试验地点 试验以水稻品种宁粳 8 号为供试材料，于 2016 年 7 月-10 月在南京农业大学进行。 1．2 试验设计 采用水卷苗育秧方法于人工气候箱中湿润育秧，播种后 5 d使用水卷苗育秧营养液培养液浇灌，播种后 15d（叶龄约3.5）进行不同浓度褪黑素 1 mg/L（TL） 、50 mg/L（TM） 、100 mg/L（TH）进行浸根处理12 h ，浸根结束后使用清水对根系多次冲洗，清除残留褪黑素，之后对秧苗剪根处理（从根基部起保留 1 cm）,以2苗/穴定植于泡沫板上，继续在人工气候箱中进行水培，试验同期设置清水浸根为对照（CK）。试验在褪黑素处理前和剪根后 6、9、12 d分别取样10 株，3次重复，同期获取鲜样，采用液氮速冻后于-80℃条件下保存。 1．3 项目测定和方法 1．3. 1 形态指标的测定 各次取样测定秧苗地上部鲜重、株高、茎粗、根数等形态指标及、根系活力和干物质重，各指标测量方法如下： 鲜重：获取样品用精度为0.01的分析天平称量。 株高：使用米尺测量水稻秧苗从根系着生点起向上至绿色叶片顶端距离为株高。 茎粗：使用直尺测量水稻秧苗根系着生点以上 1 cm 处茎秆宽度为茎粗。 根数：在秧苗剪根后 6、9、12 d观察新生白根数，并记录。 根系活力（α-萘胺法） ： （1）标曲制作：取 6支20 ml 刻度试管，编号，按表（表1）配制每管含量为 0~50 μg的α-萘胺标准溶液。加入表中试剂，摇匀后室温下（20~25℃）静置5 min 显色，然后加入蒸馏水，使每管总体积为 20 ml，摇匀，在 20~60 min内，以0号管为空白对照，在520 nm 波长处测定每管吸光度（A）值。 表1 标准α-萘胺溶液曲线制作 Table 1 The standard curve of α- Naphthylamine 试剂 编号 0 1 2 3 4 5 50 μg/ml α-萘胺溶液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 蒸馏水（ml） 11 10.8 10.6 10.4 10.2 10 磷酸缓冲液（ml） 1 1 1 1 1 1 1％对氨基苯磺酸溶液（ml） 1 1 1 1 1 1 100 μg/ml亚硝酸钠溶液（ml） 1 1 1 1 1 1 每管α-萘胺含量（μg） 0 10 20 30 40 50 （2）样品测定：把待测定水稻根用水洗净，再用吸水纸吸干根上的水后，称取 1～2 g，放入100 ml 三角瓶中，加入 50 μg/ml α-萘胺溶液和磷酸缓冲液的等量混合液 50 ml轻轻摇动并静置，10 min 后从瓶中取 2 ml 溶液，至 20 ml 刻度试管，加入 10 ml 蒸馏水，混匀后再加入1％对氨基苯磺酸溶液 1 ml 和 100 μg/ml 亚硝酸钠溶液 1 ml 摇匀后室温下（20~25℃）静置 5 min显色，然后加入蒸馏水，使总体积为 20 ml，摇匀，在 20~60 min内，以标准曲线0 号管为空白对照，于520 nm 波长处测定吸光度（A）值。以上其余溶液塞好瓶塞，在 25℃下反应振荡3 h。反应结束后再取2 ml 溶液放入刻度试管，待测（第二次取液）。 （3）结果计算：根据第一次和第二次样液所测得的吸光度值，从标准曲线查出 α-萘胺含量，按下公式计算 α-萘胺氧化值。 1．3. 2 叶绿素含量的测定 准确称取 0.1 g新鲜秧苗叶片于 10 ml 95%乙醇中避光提取36 h，在波长 652 nm 处测定吸光度并按下式计算：CT = A652 ×1000/34.5 。 1．3. 3 可溶性蛋白的测定 （1）标曲制作：配制0.01 g/ml Pr标准牛血清蛋白液，取 6支试管，按照下表(表2)加入试剂，摇匀后加入 5 ml 考马斯亮蓝溶液，静置 2 min 后在波长595 nm 处比色，以蛋白质浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。
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