茶树发育相关CsGRF2基因克隆与功能鉴定(3)
1 材料与方法
1.1实验材料与处理
供试对象为南京农业大学园艺学院茶叶科学研究所种植的茶树品种‘龙井43’(C. sinensis cv. ‘Longjing43’)，取2年生无病虫害扦插苗的幼嫩叶片提取cDNA｡
生长环境条件:实验室设定了相对湿度为70 ± 10%，光照强度为300 μmol•m-2•s-1，白天照射16小时(25 °C)，夜间照射8小时(16 °C)｡选用不同发育阶段，即，第一､第二､第三､第四､和老叶作为实验材料(图1)｡老叶是第一年发育的叶子，此外，统一选取第三叶为激素处理的材料｡详情如下：叶片上喷洒1 mM的赤霉素(GA3处理）；1 mM的3-吲哚乙酸(IAA处理)；1 mM的水杨酸(SA处理)；1 mM的茉莉酸甲酯(MeJA处理)；0.1 mM的脱落酸(ABA处理)，在2h后采摘处理叶片｡GA3､IAA､SA和MeJA溶解于含有2%纯乙醇的蒸馏水中，而ABA则仅溶解于蒸馏水中｡用蒸馏水+2%纯乙醇的叶片，作为GA3､IAA､SA和MeJA处理的对照组，而只喷洒过蒸馏水的则被用作ABA处理的对照组｡每种处理制备3个实验重复｡茶树叶片材料收集后迅速浸入液氮中，并在–80 °C条件下储存用于RNA的提取｡
植物总RNA提取试剂盒Quick RNA Isolation Kit购自北京华越洋生物科技有限公司；大肠杆菌菌株DH5α由南京农业大学园艺学院茶叶科学研究所提供，pMD 18-T载体､Ex Taq DNA聚合酶､反转录试剂盒Prime Script RT with gDNA Eraser以及实时定量SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)试剂盒等均为大连TaKaRa生物科技有限公司产品｡
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