山楂叶螨的比较线粒体基因组学研究(2)
1.材料与方法
1.1 材料
山楂叶螨Amphitetranychus viennensis 于2016年4月1日采自中国山东泰安，寄主为桃树，样本在作为DNA提取与标本制作之前用100％的乙醇保存于－20℃的冰箱中。
1.2实验方法
1.2.1 标本制作
将保存于酒精中的螨虫挑出，在显微镜观察下操作放置于载玻片上，加入少量Hoyers溶液浸没虫体，盖上盖玻片，烘干，最终保存于南京农业大学。
1.2.2基因测序
典型的动物线粒体基因组是环状闭合的，大概有37个基因，长度在15~20kb之间，其线粒体基因排序顺序大致相同[7]，要测序一个完整的基因组，本实验采取的方法是将提取的线粒体基因组中的短片段COI基因与Cob基因，用通用引物通过PCR扩增出来，在扩增的短片段上设计特异性引物，再用特异引物扩增COI与Cob之间的半个环，将两个半环拼在一块就是一个完整的基因组。
1.2.3MtDNA提取
1、1.5mL离心管里吸入35μL的ATL备用。
2、挑虫，将无水乙醇里的虫子用消过毒的挑虫针挑到上述备用的离心管中，每管只挑一只虫子（单头）。
3、用研磨棒研磨，另用145μL的ATL冲洗研磨棒。
4、加入20μL的蛋白酶K，离心。
5、金属浴（56℃，450r，3h）。
6、加入200μL的AL，轻微颠倒离心管使产生沉淀。
7、加入200μL无水乙醇，充分摇匀至油状澄清。
8、用移液枪将液体转移到过滤柱中（移柱子），放置一会，8000rpm，1min，离心，弃下液。
9、加入500μL的AW1，放置一会，8000rpm，1min，离心，弃下液。
10、加入500μL的AW2，放置一会，14000rpm，3min，离心，弃下液。
11、超净台吹干残留无水乙醇，加入100μL的AE，放置一会，8000rpm，1min，离心，将分理出的液体吸入0.2mL的PCR管中，标记好名称，放置-24℃保存（此为高浓度mtDNA）。
12、加入100μL的AE，放置一会，8000rpm，1min，离心，将分理出的液体吸入0.2mL的PCR管中，标记好名称，放置-24℃保存（此为低浓度mtDNA）