1  材料与方法
1.1  生理形态观察材料与方法
1.1.1  材料与试剂
1.1.1.1  植物材料
    本实验以江苏省农博园葡萄基地多年生优质“白罗莎”葡萄(Rosario Bianco)为供试品种,在盛花期对花穗用50ppm的赤霉素(Gibberellin A3,以下简称GA)、50ppm的多效唑(Paclo-butrazol,PP333,以下简称PP)及清水对照处理,蘸取花穗30s,每组处理15个花穗,3次重复。在处理后初期每隔3-5天采样,果实发育期7-10天采样,液氮冻存。再形成幼果后将整果、果皮、果核区域、果肉分别冻样,储藏于-39℃冰箱中保存待用。本实验采样时间为2016年5月11日至2016年8月5日。
1.1.1.2  仪器
    体式显微镜、直尺、电显式游标卡尺。
1.1.2  方法
1.1.2.1  形态观察
采样阶段实时拍照并使用直尺测量穗长、穗宽;采样后使用体式显微镜进行微观拍摄与比对,包括:子房或果实整体及纵横剖;电子天平称取不同时期各处理单果重量;电显式游标卡尺测量后期单果横纵径。
1.2  目的基因编码区克隆材料与方法
1.2.1  材料
1.2.1.1  植物材料
    该部使用的植物材料与上一节相同。
1.2.1.2  试剂
    液氮、无水乙醇、Tris、山梨酚、硼酸、PEG、CTAB、氯化钾、EDTA、醋酸钾、氯化锂、EB、巯基乙醇、氯仿、异丙醇、无菌水(2‰RNase水溶液)等。
    反转录试剂盒、限制性内切酶、T4连接酶、T4buffer、rTaq酶、 dNTP、 DNA marker均购自Takara(塔克拉生物试剂有限公司);凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自上海捷倍思基因技术有限公司;卡那霉素、氨苄青霉素、酵母提取物、琼脂、NaCl购自南京寿德有限公司。
    pCAMBIA1302载体为实验室存样。
1.2.1.3  引物合成及序列测定
    各个基因引物由上海生工生物工程有限公司合成,序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。
1.2.2  方法
    DEPC水处理RNA提取所用的溶液和器皿工具,参照《分子克隆》有关RNA操作规范进行(Sambrook等,1989)。不同发育时期葡萄不同组织总RNA的提取参照CTAB方法(Wang.C ,2011)进行[16]。
1.2.2.1  RNA检测
    (1)使用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取总RNA。电泳图呈现28S、18S和5SrRNA三条条带。若条带较清晰明亮无明显拖带现象,且28S的亮度约为18S的两倍,OD值在1.9-2.1之间,则说明提取总RNA质量较好。
(2)用核酸蛋白分析仪,以溶解RNA的DEPC水为对照,测定260nm和280nm的光吸收值,如果OD260/OD280值介于1.9至2.1之间则符合要求。如果OD值过低或过高于此范围,说明有污染或降解。
1.2.2.2  cDNA的合成
(1)总RNA中DNA的消化
    通过建立如下DNA消化体系(见表1),将总RNA中的DNA进行消化。
表1  DNA的消化体系
Table 1  Digestive system of  DNA
RNA  
5xgDNA Eraser Buffer(2)   
gDNA Eraser(1)
RNase Free H2O(6)     ≤1ug  
 2uL
 1uL
 至10uL
Total Volume        10.0μL
在PCR仪内,42°C反应2min,4°C反应10s。
(2) cDNA第一链的合成
    参照M-MLV反转录试剂盒(Takara生物试剂公司)合成cDNA第一链,以提取的总RNA为模板。具体操作方法如下:
    ①按照如下体系(表2)在DEPC水处理过的200μL PCR管中加入试剂。
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