赤霉素诱导葡萄胚败育相关基因的克隆序列分析与时空表达特征鉴定(3)
1 材料与方法
1．1 生理形态观察材料与方法
1．1．1 材料与试剂
1．1．1．1 植物材料
本实验以江苏省农博园葡萄基地多年生优质“白罗莎”葡萄（Rosario Bianco）为供试品种，在盛花期对花穗用50ppm的赤霉素（Gibberellin A3,以下简称GA）、50ppm的多效唑（Paclo-butrazol,PP333,以下简称PP）及清水对照处理，蘸取花穗30s，每组处理15个花穗，3次重复。在处理后初期每隔3-5天采样，果实发育期7-10天采样，液氮冻存。再形成幼果后将整果、果皮、果核区域、果肉分别冻样，储藏于－39℃冰箱中保存待用。本实验采样时间为2016年5月11日至2016年8月5日。
1．1．1．2 仪器
体式显微镜、直尺、电显式游标卡尺。
1．1．2 方法
1．1．2．1 形态观察
采样阶段实时拍照并使用直尺测量穗长、穗宽；采样后使用体式显微镜进行微观拍摄与比对，包括：子房或果实整体及纵横剖；电子天平称取不同时期各处理单果重量；电显式游标卡尺测量后期单果横纵径。
1．2 目的基因编码区克隆材料与方法
1．2．1 材料
1．2．1．1 植物材料
该部使用的植物材料与上一节相同。
1．2．1．2 试剂
液氮、无水乙醇、Tris、山梨酚、硼酸、PEG、CTAB、氯化钾、EDTA、醋酸钾、氯化锂、EB、巯基乙醇、氯仿、异丙醇、无菌水（2‰RNase水溶液）等。
反转录试剂盒、限制性内切酶、T4连接酶、T4buffer、rTaq酶、 dNTP、 DNA marker均购自Takara（塔克拉生物试剂有限公司）；凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自上海捷倍思基因技术有限公司；卡那霉素、氨苄青霉素、酵母提取物、琼脂、NaCl购自南京寿德有限公司。
pCAMBIA1302载体为实验室存样。
1．2．1．3 引物合成及序列测定
各个基因引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。
1．2．2 方法
DEPC水处理RNA提取所用的溶液和器皿工具，参照《分子克隆》有关RNA操作规范进行(Sambrook等,1989)。不同发育时期葡萄不同组织总RNA的提取参照CTAB方法（Wang.C ,2011）进行[16]。
1．2．2．1 RNA检测
（1）使用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取总RNA。电泳图呈现28S、18S和5SrRNA三条条带。若条带较清晰明亮无明显拖带现象，且28S的亮度约为18S的两倍，OD值在1.9-2.1之间，则说明提取总RNA质量较好。
（2）用核酸蛋白分析仪，以溶解RNA的DEPC水为对照，测定260nm和280nm的光吸收值，如果OD260/OD280值介于1.9至2.1之间则符合要求。如果OD值过低或过高于此范围，说明有污染或降解。
1．2．2．2 cDNA的合成
（1）总RNA中DNA的消化
通过建立如下DNA消化体系(见表1)，将总RNA中的DNA进行消化。
表1 DNA的消化体系
Table 1 Digestive system of DNA
RNA
5xgDNA Eraser Buffer(2)
gDNA Eraser(1)
RNase Free H2O(6) ≤1ug
2uL
1uL
至10uL
Total Volume 10.0μL
在PCR仪内，42°C反应2min，4°C反应10s。
（2） cDNA第一链的合成
参照M-MLV反转录试剂盒（Takara生物试剂公司）合成cDNA第一链，以提取的总RNA为模板。具体操作方法如下：
①按照如下体系（表2）在DEPC水处理过的200μL PCR管中加入试剂。