赤霉素诱导葡萄胚败育相关基因的克隆序列分析与时空表达特征鉴定(4)
表2 cDNA的合成体系
Table 2 Synthesis system of cDNA
消化后的RNA
Primer Script RT Enzyme Mix I(3)
RT Primer Mix(5)
5x Primer Script Buffer2(4)
RNase Free H2O(6) 10.0μL
1.0uL
1.0uL
4.0uL
4.0uL
Total Volume 20.0μL
②在PCR仪中，37℃ 15min，85℃ 5s，4℃ 10s；
③反转后的cDNA用ddH2O进行稀释，分别稀释到 5倍，10倍；再分别用内参基因Actin标定不同样品的cDNA浓度。
④原液置于-40℃ 保存备用，稀释后的cDNA置于4℃ 短期保存。
1．2．2．3 引物设计
通过基因生物信息学分子中从NCBI下载的目标基因在葡萄中的基因序列，并分析获得其编码区，利用在线软件Primer3.0对编码区序列进行引物设计，并由上海生工生物工程有限公司合成。具体序列见表3。
表3 PCR引物序列
Table 3 PCR Sequence of primers
基因 引物名称 引物序列 退火温度
VvAGL15 VvAGL15-F1 ATGGGACGTGGTAAGATTGAGA 60.0
VvAGL15-R1 TTTAACTGCCAGAGTTGTTGG 59.7
VvAGL23 VvAGL23-F1 ATGCTTTGTGTAGTGAACATGGGGAG 63.4
VvAGL23-R1 TTACCCGAGATGGAGGACCTTCTTAT 62.6
VvLEC1 VvLEC1-F1 ATGGAGACTGGAGGCTTCCA 60.3
VvLEC1-R1 TCATTTGTACTGGGCATATGGTTC 59.1
1．2．2．4 PCR扩增反应
以上述提取的cDNA为模板，进行目的基因的PCR扩增，具体体系如下表4。
表4 PCR反应体系
Table 4 Reaction system of PCR
试剂 使用量
cDNA 2μl
PCR Forward Primer 1μl
PCR Reverse Primer 1μl
Buffer 2.5μl
dNTP 0.5μl
rRaq 0.2μl
ddH2O 17.8μl
Total 25μl反应程序：94℃， 5min； 94℃， 30S， 60℃， 30S， 72℃， 1min； 35 个循环后 72℃， 10 min；4℃保存。2%浓度琼脂糖凝胶电泳，检测目的条带。
1．2．2．5 PCR产物的回收
在切胶仪上切下 DNA 目的片段的凝胶块，使用上海捷倍思基因技术有限公司的试剂盒进行PCR产物回收，具体步骤详见产品使用说明。