水稻响应赤霉素的小RNA鉴定与分析(3)
2) 赤霉素GA3、多效唑
3) 反转录试剂盒(Taqman. Transcription Kit 200 Reactions )
4) 无水乙醇、氯仿、异丙醇:北京化学试剂公司
5) PCR引物由南京金斯瑞生物公司合成。
6) 其他常规试剂由南京农业大学种业科学系实验室提供。
1．2 方法
1．2．1 赤霉素处理
配置GA3和PAC（paclobutrazol多效唑，赤霉素抑制剂）水溶液，浓度分别为0.1mmol/L和0.01mmol/L。挑选成熟饱满的水稻种子，培养至三叶期分为6组，分别标记为CK1、CK2、GA31、GA32、PAC1和PAC2。之后对应地分别进行整株喷施ddH2O、GA3和PAC溶液，处理24小时后挑选幼嫩叶片。取样后用DEPC处理水清洗并用灭菌纸擦干，迅速将样品放入离心管并液氮瞬时冷冻以备后续提取RNA，并将部分材料放置超低温冰箱（-80℃）保存备用。
1．2．2 总RNA提取与质量检测
由于RNA非常不稳定，实验中所用的离心管、微量取样器吸头等器具均先用DEPC水处理并进行高温灭菌处理，所用研钵及各种玻璃器皿均需经过酒精灼烧，以除去RNA酶。参照Trizol试剂盒说明书进行RNA提取。
1) 在液氮环境下用研钵研磨水稻叶片，取100mg左右粉末放入预冷的2ml的离心管中，加入1ml左右的Trizol抽提液，轻轻摇匀，室温放置10min。于-80℃冻30min以上，取出后在室温下解冻，13000rpm 4℃离心5-10min（离心机需要预冷至4℃）。
2) 取出上清液加入200μL氯仿，轻轻上下颠倒混匀，冰上放置5-10min，13000rpm 4℃离心10min。
3) 取出上清液加入500μL异丙醇，上下来回颠倒混匀，-20℃放置10min（使沉淀更加彻底），12000rpm 4℃离心10min，弃上清液。
4) 在沉淀中加入1ml 75% 酒精溶解，静置2min，8000rpm 4℃离心15min，倒出酒精，重复清洗3次。
5) 室温条件下在超净工作台里风干5-10min，把管子放到冰上干燥10min，然后加入30μL DEPC水溶解，置于55-60℃ 水浴5min助溶，完成提取。保存在-80℃条件下。
质量检测
1) 使用NanoDrop ND-2000仪器测定RNA浓度和纯度（测量前先用溶解RNA用的DEPC水作为参照，调零），用于后期稀释RNA配工作液。
2) 制1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA样品质量，点入1μL（3-5μg均可）的RNA样品和已知浓度的Maker
3) 电泳后紫外光透射成像，根据照片中条带质量估测样品有否降解来检测RNA提取的质量
1．2．3 Small RNA提取与胶回收
1) 取上面提取的总RNA母液，根据其浓度加入DNase I（1μg RNA加入1.5U酶）除去DNA，置于37℃恒温水浴45min
2) 加入体系1/10体积的NaAc（醋酸钠，3mol/L）和2μL glycogen（糖原，10mg/ml）；再加入2倍体积的无水乙醇，混匀后在-20℃条件下沉淀过夜，后在14000rpm 4℃离心30min，去除上清液
3) 在沉淀中加入1ml 75% 酒精溶解，静置2min，14000rpm 4℃离心10min，去上清液，得到沉淀为小分子RNA
4) 在超净工作台里风干5-10min，最后溶解在RNase-free H2O中，完成small RNA提取
5) 配置15%变性聚丙烯酰胺凝胶（凝胶需要用DEPC处理水配置）并准备电泳槽，180V预热电泳20min后清理胶孔；将small RNA在95℃下变性处理5min，后置于冰上准备点样
6) 点样时每个点样孔点入50μg的small RNA，胶面两端点25bp Marker作为参照，设置电压200V跑35min（溴酚蓝移至胶面底部时即可停止电泳）后银染