利用大豆原生质体瞬时表达技术鉴定大豆抗病相关基因方法的建立(2)
3.2.2大豆原生质体提取步骤 12
3.2.3 DNA-PEG-Ca2+转化步骤 12
3.3 实验结果 13
3.3.1 大豆原生质体的提取 13
3.3.2 PEG介导的大豆原生质体的质粒转化 13
3.4 讨论 14
4 实验总结14
致谢 15
参考文献16
利用大豆原生质体瞬时表达技术鉴定大豆抗病相关基因方法的建立
引言
大豆是人类植物性蛋白和食用油的重要来源。在其生长发育过程中受到多种病虫害的危害，大豆花叶病毒( soybean mosaic virus，SMV) 病是众多病害中分布最广、对产量和品质影响最大的病害之一[1]。自从1915年美国首次报道大豆花叶病以来，针对大豆抗SMV的研究也全面展开,主要包括株系划分、抗源筛选、抗性遗传、抗病品种选育等等。但由于大豆基因组的复杂性,即古四倍体和冗余的重复序列,对大豆特定抗SMV基因的克隆工作尚未取得质的突破。经过多年的遗传研究工作，大多数抗SMV大豆品种的抗病基因已经精细定位在2号、13号及14号染色体各自约100kb范围[2-7]。
利用转基因来获得目标基因过表达植株或者敲除植株是验证基因功能的一般途径也是最有说服力的功能验证方法。然而，获得转化植株的过程需要耗费大量的人力物力，这一缺点极大的限制了对基因功能研究的进度[8]。大豆遗传转化方面更是普遍存在转化效率低、转化植株嵌合体比例高、转化周期长等问题。在大豆抗病研究中通过遗传转化来过表达抗病候选大量基因或者通过crispr/cas9来敲除候选大量基因都不是太可行的方法。病毒及植物寄主之间的互作有着很高的专一性，这也使得我们很难利用拟南芥、烟草等模式植物进行抗病候选基因的验证。
瞬时表达技术提供了另一种方便可行的分析基因功能的方法[9]。同转基因方法比起来，瞬时表达方法最为明显的优点是可以在导入DNA之后很短的时间内方便的检测目标基因的活性[10]。这种方法很久以前就已经获得了广泛的应用，比如：测定启动子的活性，检测蛋白的亚细胞定位，检测目标蛋白的互作蛋白等[11]。而且近些年来，植物基因组学和蛋白组学的发展极大的激发了人们对高通量的分析基因功能方法的兴趣。在双子叶植物和单子叶植物中，以病毒侵染或者农杆菌侵染为基础的瞬时表达实验已经被用来进行大规模的基因功能研究[12]，而使用原生质体进行瞬时基因表达是另一种分析基因生物活性的有效方法[11]，而且这种方法在拟南芥、玉米、烟草等植物中已经取得了成功的应用。原生质体转化效率高，而且研究表明植物的原生质体对植物激素、环境变化、病原诱导物质等的反应同完整植物组织或者植株的反应非常相似，这就使原生质体有条件成为一种有力的多才多艺的用来高通量研究植物信号转导途径的载体。Sheen等研究者通过原生质体成功的揭示了有丝分裂原激活蛋白（MAP）激酶级联反应参与氧胁迫、生长素及防御反应信号转导途径[13]。De Sutter et al. (2005)开发了用于自动进行原生质体瞬时表达实验的机器平台，并且通过该平台鉴定出烟草茉莉酸信号通路中的两个转录因子。Ping He也详细描述了利用拟南芥原生质体研究免疫反应的详细方法[14]，如图1所示。
R基因介导的植物抗病反应通常引起过敏性反应（HR），进而导致细胞死亡[15]。这一特性也是判断植物细胞是否发生抗病反应的重要指标之一。利用这一现象，可以建立通过原生质体瞬时表达技术实现抗病候选基因筛选的方法,如图2所示。虽然提取大豆原生质体的方法早有报道，然而至今没有利用大豆原生质体过表达目标基因并研究基因功能的尝试。为了实现这一目的，本实验构建了用于瞬时过表达的基于gateway技术的终端载体，并以此载体为基础，构建了GUS基因、Avh241基因的瞬时表达载体；本实验利用酶解法成功提取了大豆的原生质体，然而在尝试转入瞬时表达载体的过程中遭遇了失败，本文最后分析了原生质体转化失败的可能原因，为实验的再次进行提供参考。