大豆疫霉效应分子Avh241的寄主靶标鉴定(3)
由于疫霉菌的基因组较大，遗传转化较困难，因此相对于真菌和细菌来说，对疫霉菌致病机理的研究进展得非常缓慢。但是，随着近年来卵菌的遗传转化技术与植物瞬时转染技术的不断发展与成熟，特别是随着大豆疫霉等4个疫霉种基因组序列测序的完成，在生物信息学的帮助下，以外泌蛋白为焦点的关于卵菌致病机制机理的研究已逐渐取得一系列突破性的进展。本研究正在进行内容的主要是对大豆疫霉RxLR效应分子Avh241的寄主靶标鉴定。Avh241是大豆疫霉分泌的一个重要的胞内效应分子，通过植物瞬时表达系统发现其能够触发植物的免疫反应，而其在与其它效应子协同作用的时候又可以抑制植物的免疫反应。因此开展其功能研究对解释这类重要病原菌的致病机理具有重要的价值。研究大豆疫霉在侵染大豆过程中分泌的效应分子及其互作靶标的作用机制，对于进一步揭示病原菌与寄主互作过程中的侵染机制，控制大豆疫霉导致的病害具有非常重要的意义。本实验通过筛选Avh241的寄主靶标，并从中选择候选互作蛋白，通过Co-IP和GST Pull-Down两种技术对其进行了互作验证，为进一步理解植物与病原菌的互作机制提供了理论依据。
1 材料与方法
1．1 供试植物和供试菌株的保存和培养
实验所用供试植物为由本实验室保存的本氏烟(Nicotiana benthamiana)。烟草的培育条件为在温室中进行培育，25 ºC 、16 h光照，20 ºC 、8 h黑暗。
实验所用供试菌株为美国俄勒冈州立大学Brett M. Tyler教授所馈赠的大豆疫霉菌株P6497(Race 2)，由本实验室保存。菌株保存条件为：10 ºC条件下保存于10% V8固体培养基。
实验所用感受态菌株为由本实验室保存的大肠杆菌(Eschrichia coli)菌株JM109与农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101。
1．2 目标基因的克隆及重组质粒的构建
实验通过设计引物，PCR高保真扩增目的基因，经1% 琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收纯化得到目的片段。再将实验所需载体进行单酶切后与回收片段连接，连接反应2 h后热击转化大肠杆菌JM109感受态，37 ºC震荡培养2 h，收集菌液涂布于含有相应抗性的LB平板，37 ºC黑暗静置培养16 h。待长出单菌落后用载体引物进行菌落PCR验证阳性克隆，待提取阳性克隆的质粒验证正确后，送阳性克隆去生物公司进行测序，最终测序正确者即为实验所需的重组质粒。
1．2．1 目的基因的克隆
本实验中的引物设计过程为：先根据载体的酶切位点设计接头，再以大豆疫霉或大豆基因组DNA为模板，根据去信号肽后的效应分子基因序列进行引物设计，最后通过Infusion同源重组酶进行多片段连接，分别得到上下游引物。
得到引物后，以大豆疫霉基因组DNA为模板，根据所设计的引物进行PCR高保真扩增（所用高保真酶为Primer STAR™HS DNA Polymerase，TaKaRa）。
PCR反应参数：98 ºC 3 min；98 ºC 15 s，55 ºC 30 s，72 ºC 30-60 s（根据基因的延伸速率1kb/min及基因大小来确定），32个循环；72 ºC 10 min。
PCR反应在MJResearchPT200热循环仪上进行。
PCR产物通过1% 琼脂糖凝胶电泳进行分离，条带正确则使用Agarose Gel DNA Purificastion Kit (TaKaRa, Japan) 进行回收纯化。
实验过程中Avh241、GmHin1-1、GmHin1-2、GmHin1-3基因的克隆方法如上述所示
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