菌株Pigmentiphagasp.H8中3,5-二溴-4-羟基苯甲酸降解关键酶基因odcA的功能验证(2)
学术界关于卤代芳烃的微生物降解研究主要以氯代化合物为主，但随着以四溴双酚A和多溴联苯醚为代表的人造溴代阻燃剂的污染日益严重，溴代芳烃的微生物降解研究成为新的热点[6,7,8]。由于四溴双酚A和多溴联苯醚等结构复杂，化学性质稳定，其微生物降解机制研究进展缓慢，不适合用作研究溴代芳烃微生物降解机制的模式化合物。3,5-二溴-4-羟基苯甲酸（3,5-dibromo-4-hydroxybenzoate, DBHB）结构相对简单，同时也是一种常见的环境污染物，对人类和生态环境健康造成严重的威胁。
目前，学术界关于DBHB的微生物降解研究十分薄弱，其微生物降解途径和降解机制研究报道很少。严格厌氧菌Desulfitobacterium chlororespirans以DBHB为电子受体进行脱卤呼吸型还原脱溴产生终产物4-羟基苯甲酸，但还原脱溴基因并未阐明[9]。好氧菌株Acinetobacter sp. XB2 能对DBHB 还原脱溴生成3-溴-4-羟基苯甲酸，其还原脱溴基因以及催化机制未被阐明[10]。好氧菌株Comamonas sp. 7D-2中的还原脱卤酶BhbA和BhbA2以NADPH作为电子供体和H供体，将DBHB进行连续两步还原脱溴生成4-羟基苯甲酸，该还原脱卤机制已被阐明。此外，在好氧菌株Delftia sp. EOB-17中发现与BhbA和BhbA2同样催化机制的还原脱卤酶BhbA3[11]。除了（好氧和厌氧）还原脱溴以外，好氧菌株Pseudomonas sp. BX-1能对DBHB进行脱羧反应生成2,6-二溴苯酚，但是降解基因和催化机制未被阐明[12]。鉴于DBHB的微生物降解机制研究十分滞后，所以DBHB是用于研究溴代芳烃微生物降解机制的理想化合物。
本实验室前期从长期受卤代芳烃污染的土壤中分离筛选到一株DBHB的高效降解菌株Pigmentiphaga sp. H8，且起始降解反应是将DBHB转化为2,6-二溴对苯二酚。通过基因组测序以及比较蛋白组和比较转录组实验，推断基因组中的orf420-426基因簇参与了DBHB的降解。我们对这一段基因簇的基因进行了分析研究推测其各基因功能，如图1所示：orf420负责将DBHB氧化脱羧生成2,6-二溴对苯二酚，接着被双加氧酶orf425开环降解为4-溴-2-羟基粘康酸半醛，然后被2-羟基粘康酸半醛脱氢酶orf421转化为4-溴-2-羟基粘康酸，进一步被转化为4-溴马来酰乙酸，最后被马来酰乙酸还原酶orf426还原为3-酮乙二酸；orf422是一个潜在的转录调控因子，推测其负责调控该降解基因簇的转录；orf423是一个潜在的转运蛋白，推测其参与DBHB的跨膜运输。因此，本研究以菌株H8中疑似的降解关键酶基因orf420（odcA）为研究对象，通过基因敲除、基因回补和异源表达等实验验证odcA的功能，研究其酶学催化机制，丰富溴代芳烃微生物降解的理论基础，为溴代芳烃的生物降解和污染修复提供了新的基因和酶资源。
图1 菌株H8中DBHB降解基因簇（A）和降解途径（B）的推测
Fig. 1 Prediction of DBHB degradation gene cluster (A) and degradation pathway (B) in strain H8
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒、引物
本实验所用菌株和质粒见表1，本实验所用引物见表2。
表1 本实验所用的菌株和质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
菌株和质粒 特性 来源
E. coli菌株
DH5α 克隆载体的宿主 实验室保存
DH5α λpir 自杀性载体的宿主 实验室保存
HB101 (pRK2013) 接合辅助菌株；Kmr 实验室保存
BL21 (DE3) pET表达载体的宿主 实验室保存
Pigmentiphaga菌株
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