棉花MAPK级联途径中MAPKK与MAPKK家族基因蛋白互作分析(2)
目前，越来越多的证据表明多种信号可以激活MAPK级联系统，从而调控植物对外界的胁迫应答。植物MAPK级联信号传导途径可以传递和放大外界环境的信号，激活下游的酶及转录因子，最终激活靶基因的表达，使植物对外界信号作出生理应答[1]。
MAPK级联途径包括三个功能性串联的蛋白激酶：丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)、丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，他们通过逐级磷酸化构成了MAPKKK-MAPKK-MAPK级联反应的信号传导途径。MAPKK 能够被上游的MAPKKK磷酸化激活，磷酸化位点为Ser /Thr残基，该位点的氨基酸序列为 SXXXS/T( S表示丝氨酸，T表示苏氨酸，X代表任何氨基酸)，接着，MAPKK磷酸化MAPK，磷酸化位为Thr和Tyr残基，信号因此逐级放大并传递到下游[2,3]。因此，探索具体的信号传导途径显得尤为重要。
如今，MAPK级联途径已在多种植物中被研究，一些MAPK级联途径的组分在很多植物中都被分离鉴定出，同时在拟南芥等重要的模式植物中已经分离鉴定出几条MAPK级联信号通路。相对于其他植物来说，MAPK 级联途径在棉花中的研究较少。但也已经从棉花中分离到多个MAPK及MAPKK基因，而且棉花MAPKKK基因家族的相关研究更少。所以探讨棉花MAPK级联途径的组成以及具体的信号通路，可以为研究棉花对逆境适应的生理机制提供更多的依据。
MAPKKK作为MAPK级联信号途径的顶端组分，参与了植物多种重要生理生化过程，在信号传导过程中起到了至关重要的作用。这个家族的基因根据其激酶催化结构域可以被分为三个亚组：Raf亚组，MEKK亚组和ZIK亚组[4]。相对于MAPK和MAPKK，MAPKKK家族的基因数量最多，而相关研究却相对较少。部分已有的研究发现，MAPKKK家族基因在植物自身机体构建和抵御外界胁迫刺激等方面发挥了重要的生物学功能。到目前为止，MAPKKK的研究主要集中在拟南芥、玉米和水稻等植物中，棉花作为一种重要的经济作物，研究其MAPKKK相关的功能十分重要。
一些研究发现，一种外界信号可能经过多条MAPK级联途径传递至植物细胞内，多种信号也可能经同一条MAPK级联途径传递，从而形成一种复杂的级联传递网络[5]。同时，不同的MAPKKK，MAPKK和MAPK之间相互作用，形成多种组合，表明MAPK级联途径在信号转导途径的多样性。MAPKK位于MAPK基因的上游，MAPKKK位于顶端，MAPKKKs，MAPKKs和MAPKs数量上的不匹配表明多个MAPKKKs可能磷酸化一个MAPKKs，同时一个MAPKKs可能磷酸化多个MAPKs。为了进一步理清MAPK级联途径在植物对各种影响应答过程中的分子机制，MAPKK与MAPKKK家族基因的互作关系是研究中的至关重要的内容。
本研究通过生物信息学方法预测了到了89个棉花MAPKKK家族相关基因，并且从中分离并鉴定了52个MAPKKK家族基因。同时在之前MAPKK基因的研究基础上，利用酵母双杂交技术，对棉花MAPKK与MAPKKK家族基因蛋白互作的关系进行了初步的研究。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 植物材料 本研究所用的植物材料为陆地棉遗传标准系TM-1。该品种为南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室棉花所提供。
1．1．2 细菌菌株和质粒 大肠杆菌(Escherichia coli)菌株Top10和GV3101由本实验室保存；质粒为PMD19-T simple载体。酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株为Y2H，为本实验室保存；酵母载体为pGADT7，pGBKT7，pGBKT7-53，pGBKT7-Lam和pGADT7-Rec，均为本实验室保存。
1．1．3 培养基 LB培养基：蛋白胨10 g/L+酵母提取物5 g/L+NaCl 10 g/L。固体LB培养基：LB培养基+15 g/L琼脂。筛选的培养基需要加入相应的抗生素（卡那霉素或氨苄西林）。酵母双杂交培养基：YPDA完全培养基，SD/-Leu/-Trp，SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp。所有培养基为事先配制好，再加水，溶解，补足。酵母培养基均需要121℃高压灭菌15min。
下一篇：切花菊叶片的遗传多样性分析