荷花NnACS基因的克隆表达分析及过表达载体的构建
毕业论文关键词：荷花；乙烯；NnACSThe Cloning, Expression Analysis and Construction ofOverexpression Vector of NnACS in Nelumbo nucifera
Abstract: In this paper,the main results were as follows: 1. NnACS gene was isolated from Nelumbonucifera petals by PCR technique, The resulting gene fragment was 1478bp,a total of 492 amino acids wereencoded, and phylogenetic tree showed that the relationship between NnACS amino acid sequence and Vitisvinifera was the closest. 2.Using fluorescence quantitative PCR technology, analyzed the expression ofNnACS gene in the case of Nelumbo nucifera exogenous ethylene treatment, the results showed that Cdtreatment can promote the expression of NnACS gene, the ethylene precursor ACC can significantly upregulate the expression of NnACS gene, ethylene receptor inhibitor STS can reduce Cd induced NnACSgene expression.3.The purified NnACS and pCAMBIA1302 carrier double enzyme fragments weresuccessfully assembled by T4DNA ligase, and the overexpression vector was constructed.4.ThepCAMBIA1302 overexpression vector was transformed into Agrobacterium tumefaciens by heat shock,andthe expression vector was successfully transformed into Agrobacterium tumefaciens by PCR.Key words：Nelumbo nucifera; Ethylene; NnACS
目 录
摘要.2
关键词.2
Abstract.2
Key words.2
引言：.2
1 材料与方法.4
1．1 材料.4
1．1．1 植物材料.4
1．2 方法.4
1．2．1 总 RNA 提取.4
1．2．2 总 RNA 中 DNA 的消化.4
1．2．3 cDNA 第一链的合成5
1．2．4 NnACS 基因的克隆5
1．2．4．1 引物设计.5
1．2．4．2 PCR 扩增5
1．2．4．3 PCR 产物的回收6
1．2．4．4 感受态细胞的制备.6
1．2．4．5 连接.6
1．2．4．6 转化.6
1．2．5 序列的生物信息学分析.6
1．2．6 外源乙烯诱导 NnACS 基因的表达.6
1．2．7 NnACS 过表达载体的构建7
1．2．7．1 NnACS 限制性酶切位点的添加7
1．2．7．2 NnACS 片段的重新转接7
1．2．7．3 NnACS pMD 19-T 质粒及 pCAMBIA1302 质粒双酶切.7
1．2．7．4 连接.7
1．2．7．5 连接产物转化大肠杆菌.8
1．2．7．6 重组质粒转化农杆菌.8
2 结果与分析.8
2．1 荷花总 RNA 的提取结果.8
2．2 NnACS 基因的克隆9
2．3 NnACS 基因的生物信息学分析9
2．4 外源乙烯处理下 ACS 基因的表达情况.13
2．5 过表达载体的构建.13
3 讨论.15
3．1 NnACS 基因的克隆和生物信息学分析15
3．2 外源乙烯处理下 NnACS 基因的表达情况.16
3．3 过表达载体的构建.16
致谢.16
参考文献.16
引言：荷花（Nelumbo nucifera）为莲科莲属多年生挺水植物，是我国十大名花之一，它花大艳丽，清香远溢，盛开于酷暑高温的少花季节，古时候就成为宫廷园圃或私家庭院的珍贵花卉之一[1]。在百花中，它是唯一能花、果、种子、根同时并存，且可食用可药用可观赏的植物[2]。随着城市文化生活水平的不断提高，荷花大量应用在园林水景营造中，已成为现代都市人绿化环境必不可少的一种水生植物，具有非常广阔的应用前景。近年来大量研究表明，荷花还可以清除重金属污染，因此可以用作为净化水体中重金属的重要植物修复材料。孔德政等人研究发现在 Pb2+、Cd2+、Zn2+胁迫下,保护酶活性增强并保持较高水平,说明荷花有抵抗 3 种重金属污染的潜在能力[3]。黄勤超研究了荷花对黑臭河道底泥中 PAHs 和重金属的修复效果，研究表明荷花对底泥中有机污染物 PAHs 和重金属有去除效果，种植荷花后各重金属形态含量的变化有随总量减小而减小的趋势，对Cr、Cu、Ni、Pb、Cd 五种重金属具有一定的积累能力，荷花种植前，底泥生物毒性为中等毒性，经荷花修复后的底泥生物毒性降低为无毒性[4]。因此，综上所述，荷花对重金属具有一定的耐性，可作为植物修复材料用于水体净化。然而，目前国内外对荷花重金属耐性机理的研究仅集中在以上几个方面，还需要进一步探索。乙烯（C2H4）是植物中最简单的一种激素，同时是五种内源植物激素之一[5]，它参与植物的生长发育过程，另外乙烯在植物响应逆境胁迫中也起重要作用[6][7]。乙烯在植物 体 中 的 生 物 合 成 途 径 为 ： 蛋 氨 酸 （ methionine ） 在 腺 苷 蛋 氨 酸 合 成 酶（S-adenosylmethionine synthetase, SAMS）的作用下转变为 S-腺苷蛋氨酸（s-adenosylmethionine,SAM），SAM 在 ACC 合成酶（ACC synthase, ACS）的作用下形成 1-氨基-1-羧基环丙烷（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC），ACC 在有氧条件下经 ACC氧化酶（ACC oxidase, ACO）催化生成乙烯[8]。在乙烯生物合成过程中，有三个重要的酶已被鉴定和研究，这三个酶是：SAMS、ACS 和 ACO。ACC 合成酶（ACS）在调节乙烯生物合成中起关键的作用，它是催化 SAM 向 ACC转化的限速酶[9-10]。ACC合成酶可能存在于细胞质中[11]，且以单体、二聚体和三聚体的形式存在，其中以单体存在时活性最强，在催化反应时较不易失活[12-15]。ACC合成酶是由多基因家族编码的。如今已从拟南芥、番茄、苹果、香蕉、猕猴桃、梨、李、甜瓜等多个物种中克隆分离到该酶的编码基因[16][17]。目前，从拟南芥中已获得12个ACS编码基因成员（AtACS1-12）[18]，番茄中至少存在9个ACS基因成员（SlACS1a、SlACS1b、 SlACS2-8） [17]， 苹果中至少存在6个ACS成员 （MdACS1-4、 MdACS5a、 MdACS5b） [19]。王爱勤等通过对一系列已经发表的ACS基因核苷酸和氨基酸序列进行比较，结果显示，所有已经报道的ACS基因的植物中都有一个以上的多基因家族，ACS基因的编码区内DNA序列同源性大约为60%，氨基酸序列同源性一般在48%-97%左右，蛋白质同源性在50%-95%之间，mRNA分子量大小在1.8-2.1kb左右[20]。其中最大的同源性部分在多肽中部，差异量最大的是在C端[21]。近年来，乙烯已经被证明在植物抵抗逆境胁迫中起到很重要的作用[22]。研究表明，一些外部因子（如环境胁迫）可以诱导 ACS 基因的表达。在洪涝胁迫下 RP-ACS1 基因被诱导表达，并且参与促进乙烯的合成[23]。在经过大豆异皮线虫病感染的根中 ACC 合成酶基因表达上升[24]。王爱勤等在研究环境胁迫和激素诱导甘蔗 ACC合成酶基因家族3 个成员的表达时发现乙烯利可以诱导 Sc2ACS1 在叶和茎中、 Sc2ACS2 在根、 茎和叶中、Sc2ACS3 在根和茎中表达[25]。在甘蔗叶片中，Sc2ACS1 对冷胁迫、暗培养和 LiCl 胁迫均有应答[26]。此外，重金属胁迫还可以增加乙烯释放量[27]，且乙烯释放量越大的生态型对重金属的抗逆性越强[28]，说明乙烯与植物重金属抗逆性关系密切。有研究表明 Cd 胁迫也可以诱导拟南芥 ACS 基因的表达[29]。刘艳菊发现不同浓度 Cd 处理的拟南芥幼苗ACS2 基因表达水平出现了显著地变化， 证明乙烯参与植物响应 Cd胁迫以此来文持植物的正常生长发育[30]。同时，研究发现，重金属胁迫与植物的乙烯释放量也具有一定相关性[31]。本研究拟以‘微山湖红莲’为试材，在验证乙烯调节荷花响应镉胁迫作用的基础上，通过分子生物学等手段探查镉胁迫下荷花如何通过协调乙烯相关基因反应进而调节镉胁迫应答的作用机理。在此基础上，对荷花乙烯生物合成关键基因 NnACS 进行克隆和生物信息学分析，观测其在外源乙烯处理下的表达情况，并构建过表达载体，进而明确荷花乙烯生物合成途径中参与调控镉胁迫的关键因子。为未来利用分子生物学手段对荷花进行基因改造，创造优良耐镉品种奠定理论基础，同时也为荷花作为植物修复材料提供进一步的依据。
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