荷花NnACS基因的克隆表达分析及过表达载体的构建(2)
1 材料与方法1．1 材料1．1．1 植物材料以‘微山湖红莲’作为试验材料，购自微山县荷都水生花卉基地。选取籽粒饱满的莲子，用枝剪经行破壳，然后置于 25 ℃恒温光照培养箱中用蒸馏水进行催芽培养 5-7天，期间隔一天换一次水，然后在日平均温度大于 25 ℃时，移至室外进行培养，用5%的 Hogland 培养液经行培养 14-18 天，期间 2-3 天换一次培养液。取其根、叶柄、叶于液氮中速冻后，放于-80 ℃冰箱中保存备用。
1．2 方法1．2．1 总 RNA提取1) 准备 1.5 ml离心管，121 ℃灭菌 20 min，在烘箱中将管子烘干备用；用锡纸包好研钵、研棒和勺子，烘箱中烘 4-6 h，取出烘好的研钵等冷凉待用；2) 研磨样品，取液氮冷冻的荷花样品（鲜重 1 g），在研钵中研磨至粉末状，转移至 1.5 毫升离心管中，待用；3) 将水浴锅设置为 65 ℃，把提取液（2%CTAB，2%PVP，100 mM TrisCl，pH8.0，2 M NaCl，25 mM EDTA，pH8.0）放在 65℃水浴锅预热；4) 在放入样品的1.5毫升离心管中加600 μL65℃预热好的提取液， 漩涡仪混匀30 s，放在 65℃水浴锅中水浴 2~4 min，期间涡旋震荡 3~5 次，冷却至室温备用；5) 上述混合液中每管加 600 μL 氯仿：异戊醇（v : v=24：1）进行抽提，漩涡仪震荡 5~8 min 混匀，18 ℃，10000 rpm，离心 15 min；6) 吸取上清液到新的管子，加 800 μL 的氯仿/异戊醇，漩涡仪混匀，15 ℃，10000rpm，离心 10 min；7) 吸取上清液，加入 1/4 体积的 10 M 氯化锂，充分混匀，于 4 ℃冰箱静置 16 h 或者过夜沉淀；8) 将样品 4 ℃，10000 rpm，离心 30 min；开 65 ℃水浴锅，将 SSTE（1 M NaCl，0.5%SDS，10 mM TrisCl，1 mM EDTA）在 65 ℃水浴加热；9) 去除上清液，收集沉淀，加入 500 μL 的 SSTE 缓冲液溶解沉淀；加 500 μL的氯仿/异戊醇（24：1），抽提两次至界面无明显沉淀；10)吸上清液，加入 2 倍体积的-20 ℃预冷的无水乙醇，混匀，-80 ℃放置30 min；11)取出-80 ℃的样品，4 ℃，12000 rpm，离心 20 min；12)弃去上清液，先后用 500 uL70%乙醇、无水乙醇漂洗沉淀，4 ℃，12000 rpm，离心 10 min；13)倒掉上清液，将沉淀在通风橱上晾干；每管加 30 μL 的 RNase-free ddH2O 溶解沉淀，琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测，获得总 RNA，于-80 ℃保存备用。
1．2．2 总 RNA中 DNA 的消化依照 DNaseⅠ（RNase-free）说明书对提取的总 RNA进行消化，消除总 RNA 中带有的少量 DNA 污染，吸取20-50 μg 总 RNA，建立如下 DNA 消化体系：
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