茶树中CsHSF-A1和CsHSF-A8基因的克隆与表达研究(2)
植物在生长发育和进化的过程之中，会形成错综复杂的信号转导的网络。转录因子又称反式作用因子，是一种行使调控基因表达功能的，且具有特殊结构的蛋白质分子，它参与了植物体内和生长发育相关的信号转导途径，转录因子有在适当的外界胁迫刺激之下会被激活的机制，因此转录因子在信号转导途径作用非常巨大[10-11]。转录因子在调控逆境过程中，不仅可以作为分子开关调控基因表达，而且可以作为节点传递逆境信号，以此实现调节逆境应答基因的时序性[12]。热激转录因子是植物在温度或其他胁迫的条件之下基因转录激活的信号转导通路之中重要的一部分。热激转录因子与热激元件（heat shock element, Hse）的反向重复序列区域结合之后，诱导热激蛋白（heat shock proteins, Hsps）的转录，是植物响应高低温胁迫的重要转录因子之一。作为分子伴侣，热激蛋白与其它相关蛋白的共同作用，可以减少温度胁迫对植物造成的伤害[13-15]。
在不同种类的植物之中，HSFs的分子大小和功能尽管有所不同，但结构是高度类似的[16]。经过近几年的研究，人们先后分离出很多不同类型的转录因子，最初被克隆的热激转录因子基因的植物是番茄(Solanum lycopersicum)[17]，之后先后从拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻 (Oryza sativa)等植物之中克隆出了热激转录因子的基因[18-19]。在研究中人们发现HSFA1a，HSFA2 和 HSFA3可以调节番茄的热激反应[20-21]。HSFA1和HSFA2会使得大豆(Glycine max)和拟南芥具有耐热的性能[22-23]。而且HSFA9参与拟南芥和太阳花(Helianthus annuus)的胚胎发育和种子成熟[24-25]。同时，HSFA4a提高了水稻对于重金属镉的耐受性[26]。因此热激转录因子不仅赋予植物耐热性而且参与了植物之中一些非常重要的过程从而使得植物在不适宜的环境之中生存下来。
本实验以品种名为‘安吉白茶’的茶树为材料，在其转录组数据的基础上，检索和拼接获得茶树HSF家族的转录因子基因序列CsHSFA1和CsHSF-A8。采用RT-PCR方法从‘安吉白茶’中克隆获得CsHSF-A1和CsHSF-A8转录因子基因，并根据实时定量PCR分析，对‘安吉白茶’在高低温胁迫下的表达分析进行了研究。为进一步研究高低温胁迫下茶树中HSF转录因子的转录及表达情况奠定了基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 植物材料，生长环境
本实验的植物材料为茶树品种‘安吉白茶’的二年生扦插幼苗。将幼苗种植于混合基质之中，并放置在南京农业大学园艺学院茶叶科学研究所实验大棚进行培养。混合基质的主要成分配方是营养土：珍珠岩：蛭石为2:1:1，在茶苗种下后要修剪枝条，用以减少蒸腾作用提高茶苗的成活率。其次，在栽培过程中要注意将其放置在阴凉的地方，避免太阳直射。在茶苗种下的前两周内，每三天浇一次营养液。营养液配方为：尿素10.00克，磷酸二氢钾3.00克，硫酸钙1.00克，硫酸镁0.50克，硫酸锌0.01克，硫酸铁0.03克，硫酸铜0.01克，硫酸锰0.03克，硼酸粉0.02克，同时添加了硫酸铝0.03克，加蒸馏水定容至10L，充分溶解后即为营养液。种植两周以后，每周浇一次水，保持土壤湿润。选取长势较好的，植株健康的茶树‘安吉白茶’采集幼嫩的叶片进行RNA的提取，并合成cDNA，用于茶树中两个HSF类转录因子基因CsHSF-A1和CsHSF-A8的克隆。
1．1．2 菌株与质粒
实验之中使用pMD18-T质粒载体、Ex Taq聚合酶、DL2000分子量标准、SYBR Premix Ex Taq kit购自大连TaKaRa公司；大肠杆菌菌株DH5α是本实验室保存的菌株。
1．1．3 逆境处理
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