茶树中CsHSF-A1和CsHSF-A8基因的克隆与表达研究(3)
选取‘安吉白茶’两年生健康植株6株，分为两组在光照培养箱中培养，进行高温胁迫处理（38 ℃）和低温胁迫处理（4 ℃），处理时间分别为1、2、4、8和24小时，用没有进行过处理的茶树的幼嫩叶片作为对照组。每个处理分别取3个重复提取RNA并反转录成cDNA，之后进行实时定量PCR。
1．2 实验方法
1．2．1 RNA的提取以及cDNA的合成
按Quick RNA Isolation Kit（北京华越洋公司）试剂盒的说明书从叶片样品之中提取总的RNA。后将茶树幼嫩叶片材料提取的总的RNA在1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。按照大连TaKaRa公司的Prime Script RT Reagent Kit试剂盒的说明书将RNA反转录成为cDNA，然后稀释16倍进行实时定量PCR。
1．2．2 茶树CsHSF-A1和CsHSF-A8转录因子基因的检索及引物设计
序列检索方法，即是基于本实验室测定的茶树‘安吉白茶’转录组和基因组数据，根据NCBI中热激转录因子序列在茶树转录组库中寻找同源性高的基因。找到HSF-A1和HSF-A8在转录组中的序列。其中NCBI数据库的检索方法即是，在检索框中输入检索词，检索词间默认逻辑关系为AND，检索规则基本同PubMed。
引物设计：用软件BioXM寻找基因的ORF（开放阅读框），根据基因序列，将前21~22个基因作为F，最后的21~22个基因进行反向互补作为R。一般要包括着这个基因的ORF。使得这段基因的ORF可以被扩增出来。通过软件我们确定了CsHSF-A1和CsHSF-A8的前后引物。设计并拼接出转录因子CsHSF-A1和CsHSF-A8的基因序列，分别设计两对引物如下：
CsHSF-A1-F: 5'-GGACAAGAATGTGCTTATGCAG-3'：CsHSF-A1-R:5'-TGTACAAGGTCAAACCTCTTGG-3'：
CsHSF-A8-F: 5'-AACAGTCTCAGGTCATGGCTCAGC-3'：
CsHSF-A8-R: 5'-AACACGTTATGGTGTTTGGAGGTCG-3'。
如果引物不立即使用，可以将没有稀释过的引物放在常温下进行保存，在使用的时候现将其放在离心机中离心1分钟，然后加入去离子水进行稀释。如果试剂瓶上写的是9.60则加入960微升的去离子水。
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