重组透明质酸酶包涵体复性及其酶解条件研究(2)
2.2.2 表达产物的SDS-PAGE检测 11
2.2.3 重组透明质酸酶包涵体的复性 12
2.3 重组透明质酸酶酶解条件研究 13
2.3.1 DNS法测还原糖含量 13
2.3.2 确定重组透明质酸酶的最适反应pH 14
2.3.3 确定重组透明质酸酶的最适反应温度 15
2.3.4 透明质酸酶与HA反应时HA平均相对分子量的变化 15
2.3.5 考马斯亮蓝法测蛋白含量 15
3 结果与分析 17
3.1 透明质酸酶基因的诱导表达及表达条件的优化 17
3.2 重组透明质酸酶包涵体复性结果 17
3.3 重组透明质酸酶的最适酶解条件研究 18
3.3.1 重组透明质酸酶的最适pH检测 18
3.3.2 重组透明质酸酶的最适温度检测 19
3.4 重组透明质酸酶酶解HA时的分子量的变化检测 19
4 结论 21
致谢 22
参考文献 23
1.前言
1.1 透明质酸酶概述
透明质酸是一类由重复的双糖单位[D-葡糖醛酸(1-β-3)N-乙酞-D-葡糖胺(l-β-4)]n构成的蛋白质分子量较高的线性非硫酸化多聚阴离子GAGs，这种双糖单位由D-葡糖醛酸和N-乙酞氨基葡糖组成的，而透明质酸酶(HAase)则能够特异性地降解透明质酸[1]。透明质酸酶可以使生物体对药物的吸收加快，这是因为它具有能够使部分积存的渗出液和血液的扩散速度加快的功能[2]。治疗过程中，有时必须要使用需通过静脉滴注的药物，但这类药物的缺点往往是给药时间过长，而如果同时使用透明质酸酶，就可以将静脉滴注改进为皮下注射，也可以改进为肌内注射，这样能够使药物的吸收加快，缩短治疗时间。
1.1.1 透明质酸酶的分类
从分子遗传学水平将透明质酸酶共分为2大家族，即原核生物透明质酸酶家族与真核生物透明质酸酶家族。1971年，Meyer根据透明质酸酶降解透明质酸的不同机理以及底物特异性的差异将透明质酸酶分为以下3类(图1.1）[3-6]。
透明质酸酶的分类
（1） 透明质酸-4-聚糖水解酶( EC3.2.1.35)
透明质酸-4-聚糖水解酶为内切-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，哺乳动物睾丸、动物毒液及溶酶体是其主要来源，同时，透明质酸-4-聚糖水解酶还具有转糖苷酶活性的作用，它能作用于β-1,4糖苷键，进而将透明质酸降解为四糖，这类酶液还具有降解软骨素和硫酸软骨素的作用。按照碳水化合物活性酶数据库(CAZY)酶学分类标规则，哺乳动物透明质酸酶属于糖苷水解酶56家族，它对于内切透明质酸的β-1,4糖苷键具备随机性，并且伴随着生成聚合度缩小若干单位的全新透明质酸链，由于裂解过程需要同时释放出多个四糖，哺乳动物透明质酸酶也具备转糖苷酶活性，以便更为及时地转移裂解后的四糖，直到最终完全降解为四糖产物。
（2） 透明质酸-3-聚糖水解酶( EC3.2.1.36)
透明质酸-3-聚糖水解酶为内切-β-葡萄糖醛酸苷酶，在自然界能够从水蛭以及十二指肠虫体内提取分离得到。该酶通过作用于β-1,3糖苷键达到降解透明质酸的作用，经实验检测，反应终产物为四糖或者己糖。
（3） 透明质酸裂解酶(EC4.2.2.1）
微生物来源的透明质酸酶主要分布于细菌、病原真菌以及噬菌体中，既可降解透明质酸也可作用于软骨素和硫酸软骨素，通过裂解β-1,4糖苷键断裂和β-消去作用得到4,5-不饱和双糖。细菌透明质酸酶与哺乳动物透明质酸酶由于属于不同的CAZY家族，其降解透明质酸的过程大不相同，其内切透明质酸的β-1,4糖苷键具有严格的顺序性，每次内切作用只释放出1个双糖，并且伴随着对侧链基团外切修饰作用，同时生成减少1个双糖单位的全新透明质酸链，整个降解过程非常有序，直到最终得到4,5-不饱和双糖。
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