植物是固定生长的生物，无法选择生存环境，必须经受各种生物和非生物胁迫的压力。研究发现大量植物基因受到营养缺陷、干旱、高盐、极端温度等各种非生物胁迫的调控[1,2]。植物耐盐机制的最新研究成果可以总结为：通过降低植物盐胁迫的损伤程度，建立内部渗透平衡和钠离子内稳态，调控自身生长状态这三个方面。在盐胁迫下，植物常常表现出复杂的分子响应机制，包括大量积累胁迫相关渗透因子和调控蛋白，阻止细胞结构受损；或通过提高抗氧化酶及还原性物质加工酶的表达，清除植物体内的活性氧，从而减轻植株所受的盐离子毒害作用[3]。钠离子（Na+）是土壤中浓度最高的一种离子，能被大部分植物吸收，在高盐胁迫下，Na+毒害是植物细胞内最主要的离子毒害[4,5]。为使作物能正常生长，植物需要在胁迫条件下建立新的离子稳态，通过将Na+外排出细胞膜或者泵入液泡储存起来的方式来维持体内的离子平衡。

研究发现植物MicroRNA（miRNA）也参与了盐胁迫调控机制。miRNA是一类由20~24个核苷酸组成的内源RNA分子，不翻译产生功能蛋白，通过DNA甲基化修饰改变染色质结构、降解mRNA转录产物、以及抑制蛋白翻译三个方面调节细胞各种生理生化活动[6]。拟南芥miR393是少数几个被报道受到逆境胁迫诱导的miRNA之一，其靶基因TIR1/AFBs家族是生长素受体[9-11]，处在生长素信号转导的关键位置，对植物逆境生长有着重要的研究意义。miR393是一段21个核苷酸组成的miRNA分子，在多种植物中保守[7]。研究发现miR393的表达量在高盐下（300mM NaCl）有1.55倍的上调[8]。水稻miR393在转录后水平负调控生长素受体基因OsTIR1和OsAFB2，影响生长素信号通路，miR393过表达植株分蘖多、开花早，盐敏感性增高；反之，OsTIR1或OsAFB2过表达植株对盐的耐受性更强[12]。但有关植物miR393及其靶基因如何在拟南芥中起作用，从而增强植株的盐胁迫耐受性仍有许多问题需要解答。

    本研究拟使用抗miR393作用的mTIR1基因过量表达转基因系、靶基因功能缺失突变体tir1-1等材料，以野生型拟南芥为参照，考察盐胁迫下各种株系的耐受能力。从渗透因子，抗氧化酶及离子平衡等角度入手，测定脯氨酸、SOD活性和丙二醛产生量变化等生理数据，综合分析过量表达mTIR1如何参与植物耐盐胁迫应答，发挥了怎样的潜在作用机制，为植物的耐盐机制研究提供新的数据和参考。

1 过表达mTIR1影响拟南芥的盐胁迫耐受性

1.1 材料与方法

1.1.1 材料

用于盐胁迫耐受性实验的拟南芥包括：Columbia-0野生型，转基因纯合35S:mTIR1-7，35S:mTIR1-9，35S:MIR393a-1，35S:393MIRa-6，35S:MIR393b-1，35S:MIR393b-2株系，以及突变体tir1-1，quadruple拟南芥在光照培养室内培养，控制恒温22~24 ℃，湿度60%，16 h光照/8 h黑暗。

1.1.2 主要试剂和主要使用仪器

主要试剂：B5培养基（sigma），NaCl，丙酮，无水乙醇。

主要使用仪器：紫外分光光度计，恒温恒湿光照培养箱，超净工作台，纯水仪，pH计等仪器。

1.1.3 盐胁迫下种子萌发率统计

①将适当的拟南芥种子置于1.5ml的离心管中，1 ml 70%酒精混匀3 min，并小心吸除。

②1.5 ml 10% NaClO混匀10 min后吸除。

③无菌水1 ml洗种子4~5遍，每次清洗时要吹。

④第四次时加入1.5 ml无菌水静置8 min，吸出后再水洗1~2遍。

⑤剩少量水，用灭菌的1 ml移液器将表面消毒后的种子点在分别含NaCl（0 mM，100 mM，150 mM，200 mM）的新鲜培养基上进行培养。每个株系80颗种子，透气胶带封口后置于4 ℃的冰箱中春化2 d，破除种子休眠。