目前，哺乳动物中已经发现了19个Wnt家族蛋白成员[6]，在小鼠头面部发育过程中也有多种Wnt表达，其中部分对头面部发育的调控已经被研究：小鼠Wnt9b基因主要在胚胎外胚层表达，其突变会导致唇裂或者腭裂并伴随肾发育缺陷，研究发现Wnt9b很可能在腭板融合过程中起作用[7]；Wnt11在小鼠舌头板的腭突中缝上皮区表达并且通过和Fgfr1b作用介导了舌头融合过程中中缝部分的细胞凋亡；Wnt5a主要在小鼠舌头间充质部分表达，敲除Wnt5a及其受体Ror2也会导致腭裂的发生。在舌头发育过程中，WNt信号也起到了至关重要的调控作用。研究显示，Wnt信号起始了蕾的发育，加强Wnt信号会使蕾变大变多，而下调Wnt信号贼会导致蕾发育停止。

Wnt信号通路是个复杂的网络，包含了多种受体及下游蛋白，那么我们知道，Wnt分子是从其产生细胞中分泌转运出来再和其受体作用激活下游通路的，这个合成、转运的过程也受到相应的分子控制调节，其中之一就是Wntless蛋白[9]。Gpr177是果蝇Wntless在小鼠中同源蛋白，果蝇Wntless最早在2006年发现对Wnt具有分泌调控作用，之后也有多个研究数据也支持此结论。2009年，PNAS杂志首次报导了哺乳动物Gpr177，该研究发现Gpr177敲除的小鼠胚胎体轴无法建立，并且Gpr177也是Wnt产生和转运的必要因子[10]。

本实验室使用Gpr177作为研究对象，前期研究结果显示，舌头表皮Wnt信号活性下调也会导致舌头的结构发生变化。因此，我们观察Gpr177缺失引起的舌头发育缺陷，研究其在舌头发育过程中的表达方式，并比较Gpr177突变体与正常的野生型的舌头的形态学和组织学特征，进一步测定突变体舌头中受Gpr177缺失而引起的细胞的增殖和凋亡情况，结果发现Gpr177在小鼠舌头发育过程中的舌头表皮，间充质和肌肉组织都有表达；此外，我也初步的对E12.5时期舌头的细胞增殖水平进行BrdU标记分析，并且通过TUNEL染色的方法检测了Gpr177的突变体小鼠胚胎舌头和野生型的细胞死亡情况，发现细胞死亡不是造成舌头突变体缺陷型的生物学原因。

二、实验内容：

2.1 分析Gpr177和Wnt信号在小鼠胚胎舌头发育过程中的时空表达

首先对小鼠胚胎上腭发生过程中（胚胎E11.5到E14.5天）Gpr177基因在头面部的时空表达做详细的分析，这有助于解释Gpr177在上腭发育过程中的作用。我们还将用Gpr177免疫组化的方法检测Wnt信号在上腭发育过程中的时空表达，并比较Gpr177和已知Wnt信号在上腭育各个时期和组织的共定位。

免疫组化，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术。通过提取细胞中的生物学物质并作为抗原（此即为一抗，用来引发第一次的抗原抗体反应），来使得动物产生免疫反应，并生成相应的抗体物质，那么此抗体即可以作为二抗，进一步用来去探测细胞中相似的抗原物质`优尔^文*论|文\网www.youerw.com。如果想要明显的观察到并区分产生抗原抗体反应的细胞内物质，则需要对发生相关免疫反应的部位进行染色，才能得以定性定量研究。

对抗原和抗体的要求：具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。 -对抗体的要求：纯度高、比活性强；高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。 -对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。

2.1.1石蜡切片免疫荧光试验方法：

（1）、二甲苯      15min×2次      常温