9 苦蘵 Physalis angulata Pan1 江苏省南京市栖霞区

10 苦蘵 Physalis angulata Pan2 浙江省宁波市宁海县

11 苦蘵 Physalis angulata Pan3 浙江省台州市

12 苦蘵 Physalis angulata Pan4 浙江省金华市浦江县

13 毛苦蘵 Physalis angulata var. Villosa PaV1 浙江省台州市临海县

14 毛苦蘵 Physalis angulata var. Villosa PaV2 浙江省台州市临海县

  除了以上材料外还需DNA提取、PCR扩增等步骤的材料，如下：

①100~1000ul、10~100ul、2~20ul、0.5~10ul、0.1~2ul的移液枪。

②1.5ml和0.2ml离心管、吸附柱、水浴锅、手套、移液枪枪头、DNA检测仪、PCR扩增仪、电泳器材、EDTA缓冲液、琼脂粉、电子天平、称量纸、废液缸、离心机、冰块、研钵、小勺、石蜡、液氮。

③CTAB—free、Buffer PCB、氯仿、Buffer BD、无水乙醇、PW Solution、Wash Solution、TE Buffer、ddH2O（双蒸水）、Buffer、dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）、Primer（引物）、Taq聚合酶

1.2 方法：

1.2.1 DNA提取方法:

    DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此DNA的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。DNA提取方法主要有CTAB法、SDS法、研磨方法、碱裂解方法、酶方法等。

    本次试验所用的是CTAB法（原理：CTAB—十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（＞0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。）注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。

   步骤：①将50-100mg的新鲜植物组织在液氮中充分研磨成粉末，并转移至1.5ml的离心管中，静置5min。

②加入600ul 65℃预热的Buffer PCB。震荡混匀，置于65℃水水浴40min，间或混匀。

③待冷却至室温后，加入等体积的氯仿，充分混匀，12000 rpm 离心5min。吸取500ul上层水相至一个干净的1.5ml的离心管中。

④加入等体积（500ul）Buffer BD，点到混匀3-5次，再加入等体积的无水乙醇，充分混匀后用移液器将其全部加入到吸附柱中，室温静置2min。10000 rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液。

⑤将吸附柱放回收集管中，加入500ul Pw Solution（75%异丙醇），10000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。

⑥将吸附柱放回收集管中，加入500ul Wash Polution（75%无水乙醇），10000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。

⑦将吸附柱放回收集管中，12000 rpm离心2min。取出吸附柱后倒掉离心管中废液。

⑧去除吸附柱，放入一个新的额1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入75ul 65℃预热的TE Buffer，静置3-5min，12000 rpm离心2min，得到的DNA溶液检测后置于-20℃保存或直接用于后续实验。