水稻株高和穗长的QTL定位(3)
1.3.2.1 DNA提取
于分蘖期随机选取每株幼嫩叶片，以行为单位编号装入自封袋冷藏，带回实验室采用CTAB法提取DNA，具体方法见表1。
表1 群体DNA提取简化步骤
步骤 操作说明
1 将新鲜的叶片剪碎，移至2.0ml离心管中，加入玻璃珠，盖好离心管盖。将离心管放入磨样盒中，置于液氮中速冻3min左右，取出磨样盒，震荡研磨3min。
2 在离心管中加入600μl 2%的CTAB提取液，置于65℃烘箱中保温30min，期间每隔10min颠倒混匀一次。
3 加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）混合液，充分颠倒混匀，65℃保温 20 min。
4 12000 r/min离心 8 min，吸取 200 μl 上清液移入 1.5 ml 离心管中。
5 加入等体积预冷的异丙醇，轻轻的颠倒混匀，静置 2 h 或-20℃过夜。
6 5000r/min，离心 10 min，倒掉上清液。75%乙醇洗涤 2 次。沉淀干燥 24 h。
7 离心管中加入 200 μl 的 ddH2O，溶解 24 h 后备用。
1.3.2.2 多态引物的筛选
SSR标记和Indel标记作为群体遗传作图的标记。SSR引物根据Gramene公布的序列，由上海翰宇生物公司合成。依据日本晴和93-11基因组序列同一座位上插入和缺失碱基差异，设计Indel标记，优先选择插入和缺失10个碱基以上的位置设计Indel标记，并验证引物序列在基因组的唯一性。标记的物理位置参照日本晴基因组序列。筛选亲本间具多态性的SSR标记，选择均匀分布于12条染色体上标记，用于群体基因型分析。共选取2134个标记用于筛选亲本茭白稻和Saber上的多态性标记，共筛选到126个具有多态性的标记，经过筛选，选出其中多态性较好的82个标记用于F2群体的基因型鉴定。
1.3.2.3 PCR扩增及电泳检测
PCR反应10ul体系：1μl DNA（20ng/μl），上下游引物（10μM）各0.5μl，0.2μl dNTP（2.5mM），1μl10×Buffer（含Mg2+），0.1μl Taq polymerase（2.5U/μl），6.7μl ddH2O。PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸40s，32个循环；72℃延伸10min；10℃保存。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，PAGE凝胶制备：依据PCR产物的大小制备6%～10%的聚丙烯酰胺凝胶。8%PAGE的配制（以1个电泳槽为例）：三角瓶中依次加入ddH2O 28ml，40%丙烯酰胺/N，N-亚甲基双丙烯酰胺母液8ml，10×TBE 4ml，10%过硫酸铵400μl，最后加入TEMED 40μl。充分震荡摇匀，倒入垂直电泳槽玻璃板夹层中，赶去气泡，插入梳子，凝固1h。电泳：凝胶凝固后，倒入0.5×TBE电泳缓冲液，小心拔去梳子。每个PCR反应管加1μl的溴酚蓝，短暂离心。上样2.5μl，恒压200V电泳1h 20 min。