1.3.2.1  DNA提取
于分蘖期随机选取每株幼嫩叶片,以行为单位编号装入自封袋冷藏,带回实验室采用CTAB法提取DNA,具体方法见表1。
表1  群体DNA提取简化步骤
步骤    操作说明
1    将新鲜的叶片剪碎,移至2.0ml离心管中,加入玻璃珠,盖好离心管盖。将离心管放入磨样盒中,置于液氮中速冻3min左右,取出磨样盒,震荡研磨3min。
2    在离心管中加入600μl 2%的CTAB提取液,置于65℃烘箱中保温30min,期间每隔10min颠倒混匀一次。
3    加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)混合液,充分颠倒混匀,65℃保温 20 min。
4    12000 r/min离心 8 min,吸取 200 μl 上清液移入 1.5 ml 离心管中。
5    加入等体积预冷的异丙醇,轻轻的颠倒混匀,静置 2 h 或-20℃过夜。
6    5000r/min,离心 10 min,倒掉上清液。75%乙醇洗涤 2 次。沉淀干燥 24 h。
7    离心管中加入 200 μl 的 ddH2O,溶解 24 h 后备用。
1.3.2.2  多态引物的筛选
SSR标记和Indel标记作为群体遗传作图的标记。SSR引物根据Gramene公布的序列,由上海翰宇生物公司合成。依据日本晴和93-11基因组序列同一座位上插入和缺失碱基差异,设计Indel标记,优先选择插入和缺失10个碱基以上的位置设计Indel标记,并验证引物序列在基因组的唯一性。标记的物理位置参照日本晴基因组序列。筛选亲本间具多态性的SSR标记,选择均匀分布于12条染色体上标记,用于群体基因型分析。共选取2134个标记用于筛选亲本茭白稻和Saber上的多态性标记,共筛选到126个具有多态性的标记,经过筛选,选出其中多态性较好的82个标记用于F2群体的基因型鉴定。
1.3.2.3  PCR扩增及电泳检测    
PCR反应10ul体系:1μl DNA(20ng/μl),上下游引物(10μM)各0.5μl,0.2μl dNTP(2.5mM),1μl10×Buffer(含Mg2+),0.1μl Taq polymerase(2.5U/μl),6.7μl ddH2O。PCR反应程序:95℃预变性5min;95℃变性40s,55℃退火40s,72℃延伸40s,32个循环;72℃延伸10min;10℃保存。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),PAGE凝胶制备:依据PCR产物的大小制备6%~10%的聚丙烯酰胺凝胶。8%PAGE的配制(以1个电泳槽为例):三角瓶中依次加入ddH2O 28ml,40%丙烯酰胺/N,N-亚甲基双丙烯酰胺母液8ml,10×TBE 4ml,10%过硫酸铵400μl,最后加入TEMED 40μl。充分震荡摇匀,倒入垂直电泳槽玻璃板夹层中,赶去气泡,插入梳子,凝固1h。电泳:凝胶凝固后,倒入0.5×TBE电泳缓冲液,小心拔去梳子。每个PCR反应管加1μl的溴酚蓝,短暂离心。上样2.5μl,恒压200V电泳1h 20 min。
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