作为近年来微生物研究使用最广泛的高通量测序技术，是微生物分子生态学技术中的代表，较传统研究方法省略了一些耗时步骤，以低成本和高通量为主要特征，全面快速解析微生物群落结构[8-9]。高通量测序的宏基因组技术一方面能够分析菌群群落结构，另一方面也能定性分析某定量的微生物[10]。利用高通量测序的宏基因组学技术结合数据库资源，能够得出肠道微生物发挥的主要功能，有利于将来研究动物机体的健康情况。

    本实验通过选取六头体重、体长、年龄、胎次、产奶量等参数相似的中国荷斯坦奶牛直肠采集粪便样品，提取样品总DNA后对其ITS基因序列进行PCR扩增，利用高通量测序技术快速全面地获得健康和生病的奶牛肠道微生物群落结构组成，全面解析中国荷斯坦奶牛肠道中真菌群落结构多样性，为进一步研究奶牛肠道微生态平衡对机体健康生长的影响提供理论依据。

1 材料与方法   

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1实验动物  

选取6头年龄、体重、体长、年龄体况参数相似的中国荷斯坦奶牛作为实验奶牛，编号依次为A7、46、105、108、115和1316，其具体体况参数见表1。

表1 六头中国荷斯坦奶牛体况表

实验奶牛 A7 46 105 108 115 1316

体重/kg 610 609 580 590 580 600

体长/m 1.73 1.72 1.70 1.71 1.69 1.75

年龄/岁 5 5.6 5.5 4.8 5.2 5

胎次 3 2 3 3 2 2

1.1.2试剂及仪器

主要试剂：QIAamp®DNA Stool Mini Kit试剂盒 ；UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒。

   主要仪器：高速冷冻离心机Z36HK（德国Hermle ）、PCR仪ABI GeneAmp® 9700型、电泳仪、凌恩生物Miseq测序仪、无菌采样袋、试管、无菌离心管和冰箱（样品保存）。

1.2 实验方法

1.2.1样品采集及DNA提取[11]

     在绿润奶牛养殖专业合作社里用相同饲料饲喂6头实验奶牛进行为期2周预实验后，采用直肠采样法从实验奶牛肠道中采集粪便样品，立即放置于低温冰箱中储存备用。

     从6个粪便样品中分别称取1g放置于已灭菌的干净EP管内，依照粪便试剂盒的使用说明，逐步进行实验操作提取样品总DNA，并对其进行检测。

1.2.2 PCR 扩增及高通量测序

 正向引物和反向引物分别为ITS1F和2043R进行PCR扩增，反应程序主要包括预变性、高温变性、低温复性、和中温延伸，分别对应的温度和时间为95℃（4min）、94℃（30s）、55℃（30s）和72℃（45s）。

表2  25ul PCR 反应体系组成

25ulPCR反应体系成分