盐胁迫下不同甘薯品种盐胁迫响应基因的表达情况研究(2)
2 材料与方法 2.1 实验材料 本论文的实验选用了两个甘薯品种，分别是徐薯 22 和徐薯食 5（河南省农业品种鉴定，2015），两个甘薯品种是由国家甘薯研究中心（江苏，徐州，徐州农科院）提供。2.2 植物培养与处理 挑选选取发育健康、大小一致，长势接近的徐薯 22 和徐薯食 5 样本茎蔓各30 棵进行水培生根。 待徐薯 22 和徐薯食 5 样本发根 5 天后，进行选取发育健康、茎蔓大小合适（20 cm）、长势形态接近（叶片数量约为 8-10片）、根系长度接近（长度约3-5 cm）的不定根期甘薯幼苗各 20棵， 移植到改良霍格兰培养液中（1/4 浓度，含有 2.5 mM NO3-和0.5 mM NH4+）。培养条件为光照16 h/8 h， 温度28℃/26℃，光照强度为 150 umol m-2 s-1。将营养液每两天更换一次，并利用气泵进行充氧以保持培养液中的氧气含量大于 5 mg/L。将徐薯22 和徐薯食 5样本培养10天后，选取根系大小合适、发育健康（根系长度 10 cm 左右），长势接近的徐薯22，徐薯食 5样本不定根期幼苗各 12棵，随机选取样本并分别设置为 2 组处理，每组 6 棵幼苗样本。将 4 组处理的徐薯 22，徐薯食 5 样本分别设置为对照组徐薯食 5、100 mM NaCl 盐处理组徐薯食5和对照组徐薯22、100 mM NaCl 盐处理组徐薯 22。 其中对照组的甘薯食 5和徐薯22样本始终用改良霍格兰溶液培养，盐处理则在改良霍格兰溶液中加入 100 mM 的 NaCl，培养条件与上面相同。在100 mM NaCl 处理的徐薯22，徐薯食 5不定根期样本和对照组样本培养 2天后，采集甘薯幼根样品组织并进行 RNA提取和进行荧光定量 PCR实验进行研究。在选取合适材料进行实验时，根系则选取根尖处往上 0-4 cm 的所有根组织。徐薯 22，徐薯食 5 不定根期样本材料使用和保存：鲜样立即使用或用铝箔进行分装并做好标记，将徐薯食 5 和徐薯 22 样品放入到存有液氮的瓶中迅速的急冻，之后将样品放入-80℃冰箱中防止样品 RNA降解。
2.3 实验方法
2.3.1 RNA提取 称取约 0.1 g的甘薯样品根组织，迅速使用液氮进行研磨成粉末，然后加入1 mL的Trizol试剂，盖紧盖子，充分剧烈振荡15 s混合均匀，于室温静置2-3 min。之后加入0.2 mL氯仿，振荡后于4 ℃ 10000 rpm离心15 min。离心后样品分层，下层的有机相是含有蛋白和 DNA，上层水相是含有 RNA。取上清，加入 0.5 mL异丙醇，轻轻混匀，放置到室温中静置 10 min 后，看看在管底是否会显示出胶状的沉淀，如果有，即为 RNA。4℃ 10000 rpm 离心10 min 后弃去上清。向所得的沉淀中加入1 mL 75%的乙醇，轻轻混合均匀。4℃ 10000 rpm 离心5 min 后弃上清。最后加入1 mL用无水乙醇清洗，10000 rpm 离心1 min 后弃上清，在超净台吹干，最后加入30 μL无RNase水溶解。以上操作步骤除了研磨甘薯样品和滴加SL是在普通试验台工作环境之外，其余的操作步骤均在超净工作台和在冰浴中进行。
2.3.2 RNA检测 浓度检测：使用 Nanodrop 2000检测RNA的浓度。 质量检测：把 4 μL RNA 和1 μL loading Buffer 核酸染料混匀源!自`优尔'文"论/文`网[www.youerw.com， 2-4 min 后使用1%的琼脂糖凝胶进行电泳分离，并用 5 μL的Marker作为参照，180 V 电泳10 min 后取胶拍照。 2.3.3 反转录 甘薯样品的RNA利用反转录试剂盒进行反转录，每个RNA样品反转4管，每管的反转录体系为 20 μL体系，每管的甘薯样品 RNA总量约为2000 ng，样品RNA 浓度均为 100 ng/μL。其中每管的 RNA 样品反转录体系中 4 μL 的 5*RT Buffer，1 μL的RT Enzyme Mix，1 μL 的dNTPs(10mM,each)，1 μL的Oligo(dT) 15 (50 μM)，1 μL的模板样品 RNA，
12 μL的Rnase free ddH2O，在进行第一链合成反应的条件是在温度为 50℃的条件下，进行 45 min，在温度为85℃的条件下，进行 5 min。此次甘薯样品 RNA 反转录在加样的过程中均在冰浴和超净工作台上进行，防止甘薯样品 RNA样品被污染。 2.3.4 PCR体系和程序 普通 PCR 和qPCR 扩增程序相同，只是PCR mix 不同，前者使用的 mix 为2x Es Taq MasterMix，后者使用的 mix 为UltraSYBR Mixture。反应体系（20 μL）如下： 2x mix 10 μL， Forward Primer (10 μM) 0.5 μL， Reverse Primer (10 μM) 0.5 μL，Template DNA (cDNA) 1.5 μL，RNase-Free Water 7.5 μL。 把 Mix，引物和水混合，然后加入 cDNA（cDNA 原液稀释 10 倍后使用）至20 μL，混匀后离心。设置程序为： 预变性的温度设置为 95 ℃，时间为 10 min，循环数为1；变性的温度设置为 95 ℃，时间为 15 S，循环数为40；退火和延伸的温度设置为 60 ℃，时间为 1 min，循环数为 40；溶解段的温度设置有 3个，分别为95℃时间为15 S、 60 ℃时间为1 min、 95 ℃时间为15 S，循环数均为 1。
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