1.2.1  植物蛋白组学

蛋白质组学技术应用在植物生长、发育、遗传和生理生态等生物学领域即为植物蛋白质组学[13]。研究内容主要包括：（1）植物遗传多样性。利用蛋白质组学标记把基因的多样性和表性的多样性联系在一起，应用于种间和种内的进化趋势和遗传差异等；（2）植物发育蛋白质组学。通过研究在植物不同发育时期各个器官、组织、细胞以及细胞器中蛋白质的表达差异，在蛋白质水平上阐述细胞分化、伸长及器官形成的分子机制；（3）植物逆境蛋白质组学。通过研究植物在感受逆境胁迫过程中抗逆相关蛋白质的表达，进一步了解非生物逆境胁迫的伤害机制及植物的逆境适应机制及生物之间的相互作用机制[14~16]。

1.2.2  同位素相对标记与绝对定量（iTRAQ）技术

同位素相对标记与绝对定量（Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantization, iTRAQ）技术是由美国应用生物系统公司（ ABI）在2004年推出的一种通过对氨基酸 N 端及赖氨酸残基酶解并同位素标记的技术。该技术的原理是采用同重同位素标签进行肽段标记，可同时对4（或8）种蛋白样品进行相对或绝对定量以及差异蛋白功能的生物信息学分析的蛋白质测定技术[17]。iTRAQ试剂结构包括：报告基团、肽反应基团和平衡基团。用于生命科学领域的蛋白质和基因的表达分析等。通过分析质谱中报告离子的峰强度的比值便可分析同一蛋白在不同样品之间的表达量的比值[18]。

iTRAQ技术的流程包括以下五个步骤：

（1）样品蛋白提取

（2）蛋白定量（Bradford法）

（3）蛋白酶解（Filter Aided Sample Preparation,FASP）

（4）iTRAQ标记

（5）酶解肽段离线预分离及LC-MS/MS质谱分析

1.2.3  蛋白组学的研究意义

随着蛋白质组学的发展，关于植物蛋白质组学的研究也越来越受到重视，尤其是相应逆境胁迫的蛋白质组学研究[19]。在植物的生长发育过程中，常常会受到某些非生物因素（如酸化、水涝、盐渍、干旱、高温与低温等）的影响[20,21]。这些非生物因素会严重影响植物的生长发育甚至生存，导致大量蛋白质的种类和数量发生明显变化，通过蛋白质组学，进一步揭示植物对非生物胁迫的响应机制。利用蛋白质组学为我们寻找更多、更有效的新抗逆相关基因或蛋白开辟了新的方向[22]。论文网

2  材料与方法

2.1  材料的培养与处理

挑选匀称的小麦种子，用双氧水消毒30 min，然后用蒸馏水冲洗干净，在蒸馏水中浸泡5-6 h，将蒸馏水倒掉，然后平铺在带有纱网的托盘里，放在室内，温度在25℃左右，24 h后萌发。培养一周后，开始换营养液进行培养，培养两周左右，每隔两天换一次营养液。处理组用浓硝酸调节pH=3，对照组正常处理，处理组分为短时间处理（3 d）及长时间处理（14 d）两组，在处理3 d、14 d后测定相关生理指标并进行取样并将所取样品用液氮速冻后保存在-20℃超低温冰箱备用。

2.2  实验设计

样本信息及标记情况见下表。利用iTRAQ技术筛选样本间的差异蛋白。实验标记如下表1：

表1：样本信息标记

iTRAQ标记 1 2 3

样本 对照组 短时间处理组 长时间处理组

2.3  生理指标测定

叶绿素、光合、酶活[23~25]

2.4  样本处理及 iTRAQ 定量实验流程

2.4.1  样品蛋白提取