小型仪器：

涡旋振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号：QL-901）

离心机（Thermo,型号：PICO17）

超声波细胞破碎仪（南京先欧仪器制造有限公司，型号：XO）

所需试剂及耗材：

尿素（Bio-Rad,货号：161-0731，美国）

硫尿（Sigma-Aldrich,货号：T7875，美国）

CHAPS（Bio-Rad,货号：161-0460，美国）

Protease Inhibitor Cocktail(Roche,货号：04693116001，美国)

实验步骤：

1. 将样本用液氮预冷的砸碎器砸碎

2. 将砸碎的粉末用液氮研磨。

3. 将粉末按照1：10（W/V）加入lysis buffer(7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS，片/50ml Protease Inhibitor Cocktail)，涡旋混匀。

4. 超声 60 s  0.2s on  2s off  振幅 22% 。

5. 室温提取 30 min。

6. 15,000 g   10°C   离心1 h，小心取出上清。

7. 上清中加入4 倍体积的预冷丙酮，置于－20℃过夜沉淀蛋白。

8. 15,000 g，4°C，离心10min，弃上清。沉淀用丙酮清洗后离心，再取沉淀。 重复用丙酮清洗2~3次，直至样品无色为止，待丙酮挥发后加入 lysis buffer 复溶蛋白沉淀。

9. 15,000 g   10°C   离心 20 min，小心取出上清，分装后冻存于－80℃。

2.4.2  蛋白定量（Bradford 法）

小型仪器：

酶标仪（Thermo,型号：Multiskan MK3）

所需的试剂及耗材：

尿素（Bio-Rad,货号：161-0731，美国）

硫尿（Sigma-Aldrich,货号：T7875，美国）

CHAPS（Bio-Rad,货号：161-0460，美国）

蛋白定量染液（Thermo Scientific,货号：23238，美国）

牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin,BSA）（Sigma-Aldrich,货号：2058，美国）

实验步骤：

1、采用 Bradford 法

先将样本用lysis buffer（7 M尿素、2 M硫脲、0.1% CHAPS）进行一定倍数稀释使其终浓度落在标曲范围内，稀释好的样本和标准品（将BSA用lysis  buffer溶解成系列浓度的标准蛋白）各取10 ul分别和300 ul蛋白定量染料避光反应20 min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595 nm下的吸光值，根据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线（见图1）

表2：标准品吸光值检测表

标样品浓度（mg/ml） 0 0.025 0.125 0.25 0.5 0.75 1.5

吸光值 0.047 0.473 0.575 0.679 0.947 1.025 1.33

去背景后的吸光值 0 0.026 0.128 0.232 0.5 0.578 0.939

图1：BSA标准曲线

曲线公式：y=1.0475×x2＋0.593×x＋0.0165,R2=0.9945

2、根据曲线公式计算各样品蛋白浓度（见表3）

表3：蛋白样品浓度

样品编号 1 2 3

吸光值 0.92 0.859 0.892

去除背景后的吸光值