(3) 全定量 PCR：全定量 PCR 体系为 20μl，其中包括 5μl 灭菌超纯水，10μl 2×SYBR Green PCR master mix，上下游引物各 0。5μl，4μl cDNA 样（cDNA 样稀释 30 倍）。各基因引物序列如下：

GAPDH F：CATCCACTGGTGCTGCCAAGGCTGT GAPDH R：ACAACCTGGTCCTCAGTGTAGCCCA TNF-α F：ACGGCATGGATCTCAAAGAC

TNF-α R：CGGACTCCGCAAAGTCTAAG IL-1β F：CATCCAGCTTCAAATCTCGCAG IL-1β R：CACACACCAGCAGGTTATCATC IL-6 F：CATGTTCTCTGGGAAATCGTGG IL-6 R：GTACTCCAGGTAGCTATGGTAC

Atg5 F: AAGTCTGTCCTTCCGCAGTC

Atg5 R: TGAAGAAAGTTATCTGGGTAGCTCA Atg7 F: GTGCCTCACCAGATCCGGGGTT

Atg7 R: AGGAAGGTGAATCCTTCTCGCTCG Bcl-2 F: TGGGATGCCTTTGTGGAACTAT

Bcl-2 R: AGAGACAGCCAGGAGAAATCAAAC Bax F: GTGGTTGCCCTCTTCTACTTTG

Bax R: CACAAAGATGGTCACTGTCTGC Bak F: CGAGATGGACAACTTGCCCCTGG

Bak R: CAGCTGATGCCACTCTTAAATAGGCT Bcl-xl F: GGACCGCGTATCAGAG

Bcl-xl R: GCATTGTTCCCGTAGAG

2。8  流式细胞检测分析肝脏中各群免疫细胞比例

将小鼠的肝脏用 10ml PBS 灌流，使得肝脏颜色由红到白，取下肝脏、脾脏 进行研磨。将肝脏用 400 目筛网研磨，制得单细胞悬液，500g 离心 5min，得到 的细胞沉淀用 40% Percoll 重悬，1000g 离心 10min，最下层的细胞再用 ACK 裂 解液处理去除红细胞，得到的即为肝脏中的单个核细胞。将小鼠的脾脏用 400 目筛网研磨，制得单细胞悬液，500g 离心 5min，得到的细胞沉淀用 ACK 裂解

本科毕业设计说明书 第 9   页 液重悬，冰上孵育 3 min，去除脾中的红细胞，得到的细胞重悬待用。将肝脏和 脾脏的单细胞悬液按照合适的浓度加入 CD3、CD4、CD8、CD44、CD19、F4/80、 Gr-1 等流式抗体，4°C 孵育 30min 后洗去抗体，用流式细胞仪进行检测。

2。9 统计学分析

实验结果数据显示为平均数±标准差，通过GraphPad Prism5软件分析数据， 采用配对或非配对T检验评估两组间是否有显著性差异，*p<0。05，**p<0。01，

***p<0。001，p小于0。05则被认为有显著性差别。