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2.4 实验方法
2.4.1 实验过程
（1）最佳吸收波长λ的测定
配制合适浓度的敌敌畏，测定其在不同波长下（λ的范围可在380nm~430nm之间）的吸光度△At的值，选取最大吸光度时的波长为最佳吸收波长。
（2）试剂配制及保存
①缓冲液（无水磷酸氢二钾和磷酸二氢钾）：将一袋缓冲液试剂药粉倒入500mL容量瓶中，并加入500mL蒸馏水，溶解、混匀，在室温下储存。
②底物（硫代乙酰胆碱）：向标有“底物”的试剂瓶中加入5.5mL（以试剂瓶上的标签为准）蒸馏水，溶解、混匀，在0~5℃环境下储存。
③显色剂（二硫代二硝基苯甲酸DTNB）：向标有“显色剂”的试剂瓶中加入55mL缓冲液，溶解、混匀，在0~5℃环境下储存。
④酶（乙酰胆碱酯酶）：酶已经配成溶液可以直接使用，在0~5℃环境下储存。
（3）样品提取
①选择2g有代表性的蔬菜或者瓜果皮样品，擦去表面泥土。
②叶菜剪成宽度1厘米左右的菜样，块根菜取横截面1厘米左右样品，放入锥形瓶中。
③用移液管向锥形瓶内加入10mL缓冲液，振荡1~2分钟，静置3~5分钟，待用。
④用滤纸滤去混合液中的固体物，所得的清液作为待测样品。
（4）对照（空白）测试
①按动“功能键”，切换至透射比测试模式，调整测试波长（即之前测定的最佳波长值）。
②置入遮光体，合上样品室盖子，并使其进入光路，按动“调0%T”键调T零，此时仪器显示“000.0”或者“-000.0”。完成调T零后，取出遮光体。
③按动“功能键”，切换至吸光度测试模式。置入参比（空白）样品，按动“调100%T”键，此时仪器显示“BL”延时数秒后便显示“-0.000”或者“0.000”。
④取1cm比色皿一只，用2.5mL移液管加入缓冲液2.5mL,用10uL微量进样器加入酶试剂20uL（进样2次）。
⑤用保鲜膜盖住比色皿口，右手大拇指按住保鲜膜，食指托住比色皿底部，拿起摇匀3~5秒。
⑥用100uL微量进样器吸取100uL显色剂加入比色皿，摇匀。
⑦用10uL微量进样器吸取20uL底物加入比色皿，用保鲜膜盖住皿口，迅速摇匀2~3秒。
⑧立即将比色皿放入比色池中，读取测试数据△Ao。
（5）样品测试
①按动“功能键”，切换至透射比测试模式，调整测试波长（即之前测定的最佳波长值）。
②置入遮光体，合上样品室盖子，并使其进入光路，按动“调0%T”键调T零，此时仪器显示“000.0”或者“-000.0”。完成调T零后，取出遮光体。
③按动“功能键”，切换至吸光度测试模式。置入参比（空白）样品，按动“调100%T”键，此时仪器显示“BL”延时数秒后便显示“-0.000”或者“0.000”。
④取1cm比色皿一只，用2.5mL移液管加入待测样品2.5mL,用10uL微量进样器加入酶试剂20uL（进样2次）。
⑤用保鲜膜盖住比色皿口，右手大拇指按住保鲜膜，食指托住比色皿底部，拿起摇匀3~5秒。
⑥用100uL微量进样器吸取100uL显色剂加入比色皿，摇匀。
⑦用10uL微量进样器吸取20uL底物加入比色皿，用保鲜膜盖住皿口，迅速摇匀2~3秒。
⑧立即将比色皿放入比色池中，读取测试数据△At。
2.4.2 酶抑制率的检测
（1） 酶抑制率的检测原理
在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。正常情况下，酶催化神经传导代谢产物（乙酰胆碱）水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质，用722分光光度计在412nm处测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率，通过抑制率可以判断出样品中是否有高剂量有机磷或者氨基甲酸酯类农药的存在。
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