生物转化2-苯乙醇辅因子NADH/NAD+的检测研究(6)
本实验的基本流程如下：
将接种酵母的培养基于28℃，220rad的恒温摇床培养2h后取发酵液40mL，3000rad/min，离心1min；弃上清液，记录菌体湿重；加入2mL提取液（甲醇：乙醚=1:1）混合，加等体积的酸洗玻璃珠震荡均匀后冰浴超声20min，300w，超1s停2s。震荡均匀后于4℃ 12000rad 10min离心收集上清液，将待测液用液相检测。
3.1.2提取液配比
乙醚渗透的机理是因为乙醚较甲醇更易渗透到酵母细胞壁外侧的甘露聚糖孔隙间，从而改变细胞壁和细胞膜的通透性，在不破碎和溶解细胞的情况下使得胞内物质得以释放所以乙醚和甲醇的含量配比直接影响到细胞破碎的效果。
本实验的基本流程如下：将接种酵母的培养基于28℃，220rad的恒温摇床培养2h后取发酵液40mL，3000rad/min，离心1min；弃上清液，记录菌体湿重；加入2mL提取液（甲醇：乙醚=1:1；1:4；4:1）混合，加入等体积的酸洗玻璃珠于旋窝振荡器上震荡30s，冰浴30s，反复10次后将冰浴超声20min，300w，超1S停2S于4℃ 12000rad 10min离心收集上清液，将待测液用液相检测。
3.1.3 超声功率
超声功率对酵母细胞内辅因子NAD+、NADH提取得率的影响很大，超声的功率越大其产生的热量就越大可能对辅酶产生影响，但若超声功率过小，细胞破碎不完全，导致辅酶不能释放，所以对超声功率的大小做单因素考察，确定超声功率对辅酶的影响程度。
本实验的基本流程如下：将接种酵母的培养基于28℃，220rad的恒温摇床培养2h后取发酵液40mL，3000rad/min，离心1min；弃上清液，记录菌体湿重；加入2mL提取液（甲醇：乙醚=1:1；）混合，加入等体积的酸洗玻璃珠于旋窝振荡器上震荡30s，冰浴30s，反复10次后将冰浴超声20min，功率为100w；300w；500w；800w，超1S停2S于4℃ 12000rad 10min离心收集上清液，将待测液用液相检测。
3.2 Plackett-Burman实验设计筛选关键因素
Plackett-Burman设计是用Design Expert软件对辅酶的提取试验进行 Plackett- Bur-man 设计( 实验的因素水平设计见表 3-1)。通过实验本身的特点和影响辅酶提取过程的影响因素，最终确定对9个主要因素进行筛选，分别为: 发酵液体积、加入提取液量、加入玻璃珠量、震荡次数、超声时间、超声功率、超停时间、发酵液冷冻时间、离心时间。以辅酶得率为响应值, 选择实验次数N=12的PB试验设计对上述9各因素进行考察，每个因素分别取最高和最低两个水平进行PB设计，以确定每个因素的影响因子。实验设计表如表3-1所示。
表3-1 PB试验设计方案
Table 3-1 Analysis of Plackett-Burman Design
序号 发酵液体积（mL） 加入提取液量（mL） 加入玻璃珠亮（g） 震荡次数（次） 超声时间（min） 超声功率（w） 超停时间（s） 发酵液冷冻时间（h） 离心时间（min）
1 10 5 0 10 20 200 5/10 24 20
2 10 1 0 0 1 200 1/2 0 5
3 30 1 3 10 20 200 1/2 0 20
4 10 5 3 10 1 200 1/2 24 5