生物转化2-苯乙醇辅因子NADH/NAD+的检测研究(9)
4结果与分析
4.1单因素结果分析
4.1.1 细胞破碎法
通过单因素法考察不同的细胞破碎法：反复冻融法、漩涡振荡法、超声波破胞法和有机溶剂提取法对酵母细胞内辅因子NAD+、NADH提取得率的影响。初步筛选对辅酶提取过程有影响的因素以便为下一步的实验打基础。实验结果如图4-1所示。
图4-1 各细胞破胞法对辅酶提取得率的影响
Fig.4-1 Effect of each cell discruption on the yield of total cofactor
通过对酵母细胞进行反复冻融法、漩涡振荡破胞法、超声波破胞法和有机溶剂提取法进行的实验对比，得出的数据采用SPSS17.0进行结果的分析，结果如图4-1所示，超声波破胞法和有机溶剂提取法提取辅酶（NADH+NAD+）的得率最高，相对而言反复冻融法与漩涡振荡破胞法的提取得率较低。如图中误差棒所示，a与b表示差异性显著即反复冻融、振荡法漩涡振荡破胞法与超声波破胞法、有机溶剂提取法的差异性显著。而他们彼此之间的差异性不显著。在方法的选择上要结合实验本身的特点和各细胞破碎法的优缺点。细胞破碎法的优缺点如下：
(1）漩涡振荡破胞
缺点：（1）细胞不能充分破碎使得NADH/NAD+不能完全释放；（2）在振荡的过程中由于玻璃珠间的摩擦产热而破坏NADH/NAD+。
(2）超生波破胞法
用一定功率的超声波处理细胞悬液，通常功率为300瓦使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，其原理可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。同时超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及首种类型等因素有关。其特点是操作简单，重复性较好，节省时间；多用于微生物和组织细胞的破碎。但也存在有问题一般在超声波破碎在实验室规模应用较普遍，处理少量样品时操作简便，液量损失少，但是超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活。而且大容量装置声能传递，散热均有困难，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。空化作用是细胞破坏的直接原因，同时会产生活性氧，所以要加一些巯基保护剂。
(3）有机溶剂破胞法
有机溶剂破胞法是有选择性地加入某些化学试剂，改变细胞壁或膜的通透性，从而使胞内的物质有选择性地渗透出来的一种方法。有机溶剂破胞法的机理可能是因为的乙醚易渗透到酵母细胞壁外侧的甘露聚糖孔隙间，通过氢键、范德华引力、静电引力等化学亲和力改变甘露聚糖网状结构，从而改变细胞壁和细胞膜的通透性，在不破碎和溶解细胞的情况下使得胞内物质得以释放。
通过各细胞破碎法的分析和实验自身的问题，本实验采取超声波破胞法、有机溶剂提取法和漩涡震荡法相结合的方式即综合破胞法提取酵母内辅因子保证有较高的提取效率。
综合法细胞破碎法是为了让酵母细胞内辅因子NAD+、NADH能够彻底的释放，将以上的方法适当的结合和修改，让酵母细胞能充分的破碎使酵母细胞内辅因子NAD+、NADH得以充分释放。
实验的基本流程如下：
将接种酵母的培养基于28℃，220rad的恒温摇床培养2h后取40mL的发酵液3000rad/min离心1min；加入2mL和等量玻璃珠后提取液后反复震荡10次超声功率30w，20min超1s停2s离心后液相测得的酵母细胞内辅因子NAD+、NADH得率。
4.1.2 提取液配比
由于甲醇和乙醚都能很好的增大细胞膜的通透性，使胞内的产物得意以释放。所以有必要对两者的比例进行实验，确定最适合得比例能更好的使辅因子从酵母细胞内充分释放。对甲醇和乙醚配比的单因素实验如下图4-2所示：