大豆对细菌性斑疹病抗性鉴定与遗传研究(2)
1 材料与方法
1．1 供试菌株
大豆细菌性斑疹病菌株B523和C5是从江苏省南京市南京农业大学江浦农学试验站的大豆试验田分离鉴定获得[7]，由南京农业大学植保学院植病系植物病原细菌实验室提供。将B523和C5菌株在NA平板上培养24～48h，取单菌落在KB（NB）培养基上培养，然后在28℃，220 rpm摇床上摇菌24h后用灭菌蒸馏水配成浓度为5×108 CFU/mL的细菌悬浮液，用于田间接种试验。
1．2 供试大豆及田间试验
试验所需材料分别来自美国、中国、日本、韩国和尼泊尔等24个国家地区，所用试验材料共284份。由南京农业大学国家大豆改良中心种质库提供。试验在南京农业大学江浦农学站进行。
1．3 抗性鉴定方法与分级标准
接种试验在南京农业大学江浦农学站网室进行，裂区设计，主区设接清水对照处理，穴播，每穴5~8苗，3次重复。B523和C5菌株同样设计。在大豆第3片复叶展开期进行大田接种鉴定，采用高压喷雾方法[8-10]在叶正背面喷雾接种20天后，接种后第30天左右调查各个重复的发病情况。
参照同类病害的抗病性分级标准[11]，结合试验所取得的各材料的感病度差异, 把感病度记载为 1、3、5、7、9级（表1）。不同材料的抗性等级由感病度的平均值 划分。
表 1 大豆细菌性斑疹病抗性鉴定分级标准
级别 表型调查分级标准 感病度标准 抗病反应
1 叶片无病斑或仅散生少量局限型褐色斑点，直径0.5mm左右，病斑约占叶面积1%以下 =1
高抗（HR）
3 病斑散生，较多局限型斑点或不规则型直径1mm，约占叶面积1%～5% 1.0< ≤3.0
抗病（R）
5 病斑散生，较多局限型斑点或不规则型直径2mm，约占叶面积6%～10% 3.0< ≤5.0）
中抗（MR）
7 病斑不规则，扩展相连呈小片坏死斑，占叶面积10%～25% 5.0< ≤7.0
感病（S）
9 病斑扩展，大块连片，占叶面积26%以上，叶片枯萎死亡 >7.0
高感（HS）
1.4 关联分析方法
分子标记数据来自Soybase，共31045个SNP标记。使用GAPIT中MLM_PCA+K模型进行全基因组关联分析[12]，PCA矩阵为主成分结构矩阵，K矩阵为亲缘系数矩阵，显著性水平为-log10P≥3。进一步根据关联SNP标记筛选出稳定表现的QTL。以-log10P≥3作为显著性水平，将全基因组关联分析得到的标记比对Song等（2010）发表的大豆公共图谱，得到其遗传位置，以5cm以内为标准定义为一个QTL位点[13]。
2 结果与分析
2.1大豆种质接种细菌性斑疹病B523和C5菌株的症状反应
田间接种菌株后发病大豆复叶表现为受害初呈褪绿小点，后变为红褐色不规则形病斑，直径1~2 mm，病斑中央表皮破裂似火山口而呈斑疹状。病斑周围有不明显的黄色晕圈，与报道的症状一致。受害严重时病斑汇合连片，导致叶片变褐枯死，似火烧状，叶片破裂。
2.2 大豆对细菌性斑疹病B523和C5菌株的抗性表现
从表2可见，田间接种B523菌株鉴定的284份材料中，总体表现抗病（高抗+抗病+中抗）的材料有92份，其中高抗、抗和中抗材料分别为1、22和69份，占鉴定材料的32.39%；田间接种C5菌株进行鉴定结果发现，总体表现抗病（高抗+抗病+中抗）的材料有42份，占鉴定材料的14.79%。
供试材料对两个菌株B523和C5的抗病反应都表现出相似的趋势，即高抗病个体很少，分别为1、0份。总体抗病（高抗+抗病+中抗）材料数分别为92、42份，也明显少于感病个体数。