原生质体分离的方法主要有机械法和酶解法。早期分离原生质体的方法是机械法，但机械法获得的原生质体过程非常复杂并且产量低，具有较大的局限性，而酶解法可以在短时间内快速地分离出大量的原生质体，因此目前最广泛最常用的方法是酶解法[6,8,9]。论文网

目前酶解法分离原生质体的试验中常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和离析酶。因为植物细胞壁中纤维素、半纤维素和果胶质在不同细胞中的组成比例各不相同，所以各种酶发挥的作用也各不相同。纤维素酶是一种多组分酶，包括C1酶，CX酶以及β-葡萄糖苷酶，Cl酶可将天然纤维素水解为无定形纤维素，CX酶可将无定形纤维素水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶可将纤维寡糖水解为葡萄糖，目前使用的纤维素酶主要有Cellulase R-10和Cellulase RS。果胶酶是一种聚半乳糖醛酸水解酶，可以水解果胶并生成β-半乳糖醛酸，离析酶属于果胶酶类，可水解植物细胞与细胞间的联系成分，广泛使用的是Macerozyme R-10[10]。目前在原生质体酶解中，最广泛使用的酶液组合就是纤维素酶加离析酶，但不同植物细胞的细胞壁组成差异很大，所需要的酶的种类和浓度也不相同。特别是很多木本植物，因为其生长周期长，高效的获得优质的原生质体可为其基因功能的分析提供一个高效的平台。如表1[11]列出了不同作物原生质体分离的酶组成，可以看出不同植物所用的酶液浓度可能不同，同一植物不同部位所用的酶种类和浓度也不一定相同。酶解法还需要调节渗透压来维持细胞的稳定性，目前广泛使用的渗透压调节剂有甘露醇、山梨醇、葡萄糖和麦芽糖，渗透压浓度随不同植物、细胞类型而不同，多数一年生植物使用的渗透压稳定剂浓度较低约0。3～0。5mol/L，而多年生植物则需要较高浓度的渗透压稳定剂约0。5～0。7mol/L[11]。酶溶液最适pH为5。4～5。8，在酶液中加入一定量的CaCl2·2H2O、KH2PO4起保护膜的作用[12]，加入适量的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或2-N-氮马啉-乙基磺酸（MES）稳定酶解过程的pH增加原生质体的释放量和原生质体的稳定性[13]。杂交马褂木（Liriodendron chinense×L。tulipifera），又名杂交鹅掌楸，属于木兰科，鹅掌楸属，是用中国鹅掌楸与美国鹅掌楸杂交培育而成的一个马褂木新品种[14]。其干直挺拔， 叶形古朴似马褂，是世界著名的观赏树种之一，极具开发潜力，其叶片中含有大量蜡质。拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片表皮易撕除，叶片很脆，生长迅速，生活史短暂，结实率高，体型小，基因组小，并且其全基因组测序工作已经完成。它的叶肉细胞原生质体的分离已经成为了原生质体的模式方法，分离得到的原生质体已成为植物基因工程、植物细胞学和植物物生理学研究的经典材料[15]。

表1  一些作物分离原生质体所用的酶液组成

酶液组成

材料 Cellulase

Onozuka Pectolyase Macerozyme

R-10 Hemicellulase

小麦悬浮细胞 RS  2% Y23  0。2% － －

水稻悬浮细胞 R10  1%

RS  0。5% Y23  0。1% 1% －

玉米悬浮细胞 RS  3% Y23  0。1%