2。2 实验方法

2。2。1 稀释样品液

用无水乙醇作溶剂，先取3mg槲皮素定容至25ml的容量瓶中获得0。12mg/ml的槲皮素浓溶液，再分别稀释成0。02,0。04,0。06,0。08,0。10mg/ml的槲皮素稀溶液。

2。2。2 FRAP法

测定原理：Fe3+一三吡啶基三嗪（tripyridyl一triazine，TPTZ）可被样品中还原物质还原为二价铁形式。呈现出明显的蓝色，并于593nm处具有最大光吸收，由吸光值可计算样品总的抗氧化能力[11]。

配制试剂：结合向灿辉[11]，陈玉霞[12]等人的方法配制FRAP工作液①10mmol/L的TPTZ（2,4,6-三吡啶基三嗪）：称取0。031234g 的TPTZ，并用移液枪吸取36％的HCl 0。1ml加入到29。9mL的dH2O中。先用1~2ml的被稀释的盐酸溶解TPTZ，再用稀释后的的盐酸将其定容至10ml规格的容量瓶中，备用；②20mmol/L的FeCl3（三氯化铁）：称取0。0324g的FeCl3，加入到烧杯中，先用1～2ml的dH2O溶解，再用dH2O将浓溶液定容至10ml规格的容量瓶，备用；③0。3mol/L的醋酸钠缓冲液：称取1。02g的醋酸钠，溶解于4ml的冰醋酸中，再用dH2O将溶解了醋酸钠的冰醋酸定容至50ml的容量瓶中，备用；将①②③按1:1:10比例混合，备用，每次实验前核定工作液的体积，必要时重新配置。

绘制FeSO4标准曲线：FeSO4浓度在0。1～1。6 mmol/L范围内与其在593 nm处的吸光值成良好线性关系，直线方程为：y=0。00412+0。2979x，决定系数为0。9994。因此把593 nm处的吸光值换算成FeSO4当量浓度是可行的。样品的抗氧化能力可以用FRAP值表示[13]。

具体步骤：取多个1。5ml离心管，用移液枪向其中分别加入不同浓度的20μL样品液和150μL工作液；置于37℃的酶标仪中静置8min，于593nm波长处测吸光值，每个处理均做三个重复，每一吸光度平行测定3次，取平均值；同浓度芦丁作阳性对照 ,用EXCEL、SPSS等处理数据。

2。2。3 超氧阴离子自由基（O2-·）体系 论文网

测定原理：邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化释放出 O2-· , 生成有色的中间产物,邻苯三酚自氧化产物最大吸收波长为325nm，而O2-·清除剂能使其产物在325nm处吸收峰受到抑制。当加入清除剂时可清除 O2-· ,阻止产物积累。故可通过测定加入清除剂前后其吸光值的变化来判断受试物对 O2-·的清除效果[14]。

配制试剂：①0。05mol/L pH8。2的Tris-HCl缓冲液：称取0。6055g的Tris用dH2O定容至50mL配成0。1mol/L的Tris溶液待用；用移液枪吸取0。9mL的36％ HCl滴加到99。1mL的dH2O中，即将36%的HCl稀释成0。1mol/L备用；取0。1mol/L的Tris溶液50ml与22。9mL的0。1mol/L的HCl溶液混合，用dH2O定容至100mL，备用；②25mmol/L的邻苯三酚溶液：称取0。03152g的邻苯三酚溶于10mL的浓度为10mmol/L的HCl中备用；③8mol/L的HCl：2mL的36％ HCl加入到1mL的dH2O中，备用；④10mmol/L的HCl：用移液枪吸取浓度为0。1mol/L的HCl 1mL加入到9mL的dH2O中即可，备用；

具体步骤：先将Tris-HCl缓冲液在25℃水浴锅中预热20min；按表1顺序加完试样后，再于25℃恒温水浴锅中准确反应5min；最后取0。5ml的8mol/L HCl终止反应；取200μL最终反应液于点样板中，用酶标仪于325nm处测吸光值，每一吸光度平行测定3次，取平均值；同浓度芦丁作阳性对照 ,每个处理均做三个重复。按公式1计算自由基清除率，并用EXCEL、SPSS等处理数据。

O2-·清除率（%）[14] =[1-剩余的氧自由基/生成的总氧自由基]×100% =[ 1-（A1-A2）/(A3-A4)]×100%                                      （公式1）

（式中，A1：加蒸馏水、邻苯三酚溶液后体系的吸光值；A2：以10mmol/L盐酸代替A1中的邻苯三酚后体系吸光值；A3：以样品溶液代替A1中的蒸馏水后体系的吸光值；A4：加样品后，以10mmol/L盐酸代替A3中邻苯三酚后体系的吸光值。）