4、1%木糖标准溶液:精确称取木糖1。0000g,用蒸馏水溶解定容至100ml。

5、磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲液(1L):精确称取91。288g磷酸氢二钾,用蒸馏水溶解后定容至1000ml;精确称取45。644g柠檬酸,用蒸馏水溶解后定容至1000ml;取515ml磷酸氢二钾溶液,485ml柠檬酸溶液混合,调节pH值为5。0。

6、底物采用1%木聚糖溶液:称取木聚糖1。000g,加入80ml配置好的缓冲液,转入容量瓶中,用缓冲液定容至100ml,储存于冰箱中(一般至多使用3天)。

7、3,5-二硝基水杨酸显色液(DNS):实验室中保存。

8、50*TAE: 实验室中保存。

2。2。2里氏木霉的培养

2。2。2。1里氏木霉的活化培养

将实验室保藏的里氏木霉菌种接种到PDA固体培养基平板上进行活化培养,培养温度28℃,培养2-3天,待长出菌丝体后,借助解剖刀从平板上切下小块带有菌丝体的培养基,接种到液体木聚糖酶诱导培养基中,放置于恒温摇床中,设置培养温度28℃,160r/min振荡培养。

2。2。2。2里氏木霉中木聚糖酶提取最佳时间的确定

(1)分别吸取诱导培养基培养1、3、6、9、12、24、48、72、96h的培养液;

(2)DNS法测定木聚糖酶

(3)根据测定情况,确定最佳诱导木聚糖酶的时间。

2。2。2。3 DNS法测定木聚糖酶

(1)标准曲线制作:分别吸取1%的木糖标准溶液1。0,2。0,3。0,4。0,5。0,6。0ml于50ml容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,稀释成浓度分别为200,400,600,800,1000,1200ug/ml的木糖标准液[14]。分别吸取不同浓度的稀释过的木糖标准液0。5ml于试管中,加入pH为5。0的磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲液1。5ml,DNS试剂3。0ml,在沸水浴中沸腾5min,取出后加入蒸馏水10ml并摇匀,以蒸馏水0。5ml替代稀释的木糖标准液作对照[19]。冷却后,用10mm比色皿,在波长550nm处用分光光度计测定吸光值。以吸光值为纵坐标,相应的木糖标准液的浓度为横坐标,绘制标准曲线并且计算回归方程[14]。

(2)样品吸光值的测定:吸取稀释过的样品溶液0。5ml,放置于40℃水浴锅中2分钟,加入同样处理的用pH5。0磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲液配置的1%木聚糖溶液[20]1。5ml,马上计时,在40℃水浴锅中精确反应10分钟,取出之后迅速加入3。0mlDNS试剂以终止反应,接下来在沸水浴中沸腾处理5分钟,取出之后加入10ml的蒸馏水,冷却后,用分光光度计测定吸光值。同时作空白对照。

(3)利用回归方程,计算木糖含量,确定诱导木聚糖酶的时间。

2。2。3里氏木霉总RNA的提取文献综述

(1)将经过诱导的里氏木霉的菌丝球转入离心管中,用无菌水冲洗三次之后吸净水分;

(2)取30-50mg处理过的菌丝球放入预冷的研钵里,加入液氮之后进行充分的研磨,之后加入1 ml TRIzon Reagent;

(3)加入TRIzon Reagent之后吹打均匀混合,使得样品完全裂解,在室温下放置5分钟至融化,确保蛋白质核算复合物完全分解,转入RNase-Free离心管中;

(4)加入0。2ml的氯仿,盖好管盖,剧烈震荡15秒,在室温下静置3分钟;

(5)4℃,12000rpm离心10分钟,这时样品分为三层:上层无色水相,中间层和红色有机相,RNA主要存在在上层无色水相中,将上层无色水相转入一个新的RNase-Free离心管中[14];

(6)在离心管中加入等体积的70%乙醇溶液(用无RNase水配置),上下颠倒混匀;

(7)将(6)中所得溶液全部加入已有收集管的吸附柱中。如果一次不能加完全部溶液。可分多次加入。12000rpm离心20秒,将收集管中的废液倒尽,吸附柱重新放回;

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