功能内生细菌Pn2在植物体内定殖对植物吸收积累PAHs的影响(3)
1．1．2 准备供试植物和菌株
供试植物：选取繁殖旺盛，根系生长发达的黑麦草(Lolium multiflorum Lam)作为供试植物。
菲降解功能内生细菌：Pn2，该菌3 d内对菲(100 mg•L-1)的降解率高达99%(本实验室筛选)。
1．2 实验方法
1．2．1 温室盆栽实验
采用温室盆栽法，以南京江宁区距离土壤表面0－20 cm的农田黄棕壤作为供试土壤。其理化性质：pH 6.02，其中碳含量14.3 g•kg-1，黏土含量24.7%，沙含量近七成。将土壤样品风干处理，然后过20目筛，称取1 千克的过筛土壤，将含有菲和芘的丙酮溶液添加至无污染土壤，进行混匀，充分混匀后，最终使土壤中菲和芘的浓度达到100和50 mg•kg-1。一段时间过后，丙酮挥发完毕，将污染后的土壤置于暗处，进行老化，三十天后，将老化污染后土壤取出进行盆栽实验。作为空白对照，设置添加等量丙酮的无污染土壤处理组。
实验设置6种不同处理。(1)未污染土壤＋黑麦草(UR)；(2)未污染土壤＋黑麦草＋接菌(URB)；(3)污染土壤(CK)；(4)污染土壤＋接菌(CB)；(5)污染土壤＋黑麦草(CR)；(6)污染土壤＋黑麦草＋接菌(CRB)。黑麦草种子先用75%乙醇浸泡消毒5分钟后，去除表面杂菌污染，再用去离子水进行清洗，置于恒温培养箱内，培养箱温度设置为30℃，催芽48 h。每盆(350 g土壤)种植一定数量的已经催芽的黑麦草种子，待种子生长至幼苗期，将幼苗进行间苗处理，保证幼苗的生长状况。每一盆留10株长势良好的幼苗继续培养。培养箱设置为恒温，白昼20℃，湿度为50%。培养过程中按实际情况需要加入霍格兰营养液，保证土壤养分充足。待植株高度约10 cm时，在植株根部的土壤中接种OD600 nm为2.0的菲降解菌株Pn2的菌悬液(20 mL)，培养30 天，收集植物样品。为了保证实验数据真实可靠，每一组均做三个重复。
1．3 实验分析方法
1．3．1 测定植物的生物量
将采集后植物样品用剪刀把根和茎叶进行分离，用无菌水进行冲洗，冲洗完毕后再用滤纸，挤压并吸干植物表面残存水，先测定植物根、茎叶的鲜重，再将植物放入泠藏室，冷冻三天后取出测出植物根与茎叶的干重。
1．3．2 测定功能内生细菌的定殖数量
称量一定重量的植物样品，用无菌水充分冲洗，冲洗完全后将样品置于超净台内，用一定浓度的乙醇漂洗一段时间，再用无菌水进行冲洗。把植株放入高温灭菌后的研钵，加入5 mL蒸馏水，研磨充分。吸取1 mL上清液，进行梯度稀释，并涂布于菲降解固体培养基平板上(氨苄青霉素和氯霉素的浓度均为20 mg•L-1)，将培养基放入保温箱恒温培养保温箱温度设定为30摄氏度，待平板上长出明显的菌落。
1．3．3 土壤和植物体内PAHs含量的测量
测量土壤和植物样品中菲和芘浓度的方法参照文献，大致如下：(1)冷冻干燥样品，研磨粉碎（2）每个样品超声萃取三次样品（3）萃取液收集过柱子净化先（4）洗脱（5）旋转蒸发洗脱液，用甲醇定容（6）用液相色谱法进行定量分析
植物体内PAHs积累量(A)：A = C × M，C (mg•kg–1)表示植物根或茎叶中PAHs浓度，M (g•pot–1, 干重)表示每盆植物根或茎叶的干重。植物体内PAHs的富集系数(PCF)：PCF = Cp / Cs，Cp表示植物体内PAHs浓度，Cs表示土壤中PAHs浓度。PAHs在植物体内的传导系数(TF)：TF = SCF / RCF，SCF表示植物茎叶中PAHs的富集系数，RCF表示植物根中PAHs的富集系数。
1．4 数据处理分析
用SPSS统计软件处理实验数据，用Excel进行图表的绘制。