番茄Fruit weight 2。2(FW2。2)基因控制着30%的果实重量。大豆FW2。2同源基因被发现并命名为GmFWL1。该基因调控大豆与根瘤菌之间的共生固氮作用。在玉米中发现了两个FW2。2同源基因,其中CNR1能控制植株和种子大小,CNR2被发现与植株生长和杂种优势有关。另外,鳄梨FWL基因Pafw2。2-like显著影响果实的生长[5]。最近的研究表明Fruit weight 2。2-like(FWL)基因通过调控细胞分裂,在植物的生长发育过程中起着重要的作用。此外,水稻和拟南芥FWL基因被发现参与镉胁迫的响应[6]。拟南芥FWL基因AtPCR1定位在细胞膜上,该基因过表达显著提高了拟南芥植株对镉胁迫的抗性。水稻OsPCR1也定位在细胞膜上,其表达增强了酵母细胞对镉胁迫的抗性。水稻基因组中含有8个FWL基因[5],但其他基因在镉胁迫响应中的功能尚不清楚。

本实验通过水稻营养液培养和不同浓度镉处理,采用real-time PCR分析了水稻FWL基因家族在镉胁迫下的表达模式,发现多个基因的表达被镉胁迫显著诱导,为其响应镉胁迫的功能研究奠定基础。

2  材料与方法 

2。1材料与处理

水稻品种中花11种子经过浸种、催芽后中放入人工气候箱水培,营养液配方参照国际水稻研究所(IRRI)的标准配方。生长14天后,挑选出生长一致且健壮的4叶期苗进行镉处理实验。镉处理浓度分别为0 μM,10 μM,50 μM和100 μM,以CdCl2形式加入。处理20小时后对根和叶片取样,每个处理设置3个重复。

2。2总RNA提取

2。2。1试剂

氯仿:异戊醇(24:1)、无水乙醇、DEPC H2O、DNase I、UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒

2。2。2操作步骤

参照UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒说明书进行

2。3反转录

2。3。1实验试剂论文网

第一链cDNA合成试剂盒(RevertAid Premium Reverse Transcriptase)(Thermo Scientific™ EP0733)

2。3。2操作步骤

(1)在冰浴的nuclease-free PCR管中加入以下试剂:

Total RNA                               X ul

Random Primer p(dN)6(100pmol)        1 l 

dNTP Mix(0。5 mM final concentration))   1。0 l   

Rnase-free ddH2O                       定容至14。5ul

(2)轻轻混匀后离心3~5s,反应混合物在65°C温浴5min后,冰浴2min,然后离心3~5s。

(3)将试管冰浴,再加入下列试剂:

4。0 l    5*RT Buffer

          0。5 l    Thermo Scientific RiboLock RNase Inhibitor(20U)

          1。0 l    RevertAid Premium Reverse Transcriptase(200U)

(4)轻轻混匀后离心3~5s

(5)在PCR仪上按照下列条件进行反转录反应

① 25°C 孵育          10min         

② cDNA合成   50°C    30min

③ 终止反应     85°C  5min,处理后,置于冰上放置

(6)将上述溶液-20°C保存。

2。4荧光定量PCR检测

2。4。1实验样本

将cDNA样品稀释10倍作为模板上机检测。

2。4。2实时定量PCR试验材料及仪器

定量PCR试剂:SG Fast qPCR Master Mix(2X) (BBI) 

定量PCR仪: LightCycler480 Software Setup(Roche 罗氏)

2。4。3 PCR反应步骤

(1)配制反应混合液

Reaction Component

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