胡萝卜瓣化型细胞质雄性不育atp6基因的分离和功能分析(3)
1 材料与方法
1.1 胡萝卜不育系和保持系实验材料的获取
胡萝卜的高代纯合“瓣化型”细胞质雄性不育系B493A 和它相对应的保持系B493B，A系胡萝卜不育系材料和B系胡萝卜保持系材料来源是南京农业大学园艺专业伞形科蔬菜课题组。总 DNA的提取以及目的基因的克隆用不育系与保持系胡萝卜的新鲜幼嫩叶片进行；所有材料均用锡箔纸进行包装，然后用液态氮迅速冷冻并于-80℃保存起来备用。
实验试剂购于 Life Technologies（原 Invitrogen）；RNase Free DNase I 和 oligo d(T)18primer 购于宝生物工程（大连）有限公司；Real Master Mix(SYBR Green)购自天根生化科技（北京）有限公司。
1.2胡萝卜DNA的提取方法和步骤
1.2.1胡萝卜DNA提取试剂及其保存
缓冲液GP1（Buffer GP1）
缓冲液GP2（Buffer GP2）
缓冲液GD（Buffer GD）
漂洗液PW（Buffer PW）
吸附柱CB3
收集管（2毫升）
储存条件如下：该试剂盒置于室内温度15到25摄氏度且干燥的环境中，可以储存12个月，更长时间的存储可以置于2到8摄氏度。2到8摄氏度条件下保存，如果溶液产生不溶性沉淀，使用前应将试剂盒内的溶液在室温放置一段时间，必要时可以在37摄氏度的条件下进行水浴并预热10分钟，以溶解沉淀。
1.2.2胡萝卜DNA的提取步骤
取胡萝卜新鲜组织大约0.1克或者干重组织大约0.03克，加入液态氮，充分研磨；在离心管之中提前装好700微升65摄氏度预热缓冲溶液GP1，再把粉碎到位的胡萝卜新鲜组织尽快转移到这个离心管里边。并和浓度为0.1%的巯基乙醇迅速充分混合均匀，把离心管水浴20分钟，并保持65摄氏度恒温，在进行水浴试验的时候多次翻转离心管，使之多次混合样品；然后倾倒入700微升氯仿，在混合非常均匀之后，进行12000rpm的离心操作，时长要求5分钟；把刚才制备的上层水倒进新的离心管之中，轻拿轻放，谨慎操作，而后将700微升缓冲液GP2倒入其中，并保证混合均匀；把混合均匀的溶液转移到吸附柱CB3之中，离心操作30秒，12000rpm，舍弃并处理余下的液体。将500微升缓冲液GD转移到吸附柱CB3之中，离心操作30秒，12000rpm，而后舍弃余下的液体，收集管中放进吸附柱CB3；把600微升漂洗液PW加进吸附柱CB3，离心操作30秒，12000rpm，舍弃余下的溶液，收集管内放进吸附柱CB3；重复上一步操作；收集管内放进吸附柱CB3，离心操作2分钟，12000rpm，舍弃剩余溶液。在室温条件下，把吸附柱CB3静置几分钟，直到吸附材料当中剩下的漂洗液被完全晾干；在新的离心管之中放入吸附柱CB3，将50到200微升洗脱缓冲液TE悬空滴入到吸附膜的正中心，静置2到5分钟，环境温度为室温，离心操作2分钟，12000rpm，然后把收集到的溶液倒入离心管之中。
1.3胡萝卜atp6 基因克隆
本研究所用的上游引物 P1: 5' －ATGCCTATATTTCGCCGCTT－ 3'，下游引物 P2:5' －TCAATTATAAATAACCACTT— 3'，由南京金斯瑞有限公司合成。PCR反应总体积为 25 微升，其中模板 1 微升，2.5毫摩尔每升, d NTPs 4微升，10 × LA Taq buffer 2.5微升，引物各 1 微升，TaKaRa LA Taq 0.25微升，用灭菌蒸馏水补齐至25微升。扩增程序为:94摄氏度预变性 5 分钟变性、退火、延伸，实验条件分别为94摄氏度30 秒，55摄氏度45 秒和72摄氏度1 分钟，循环次数为35；最后对其保温 10分钟，温度控制在72摄氏度，保存温度为4摄氏度。然后PCR扩增的产物使用1.2% 琼脂糖凝胶对其进行电泳分离，凝胶所形成的图像经过在系统里的检验测试，拍照然后再记录下来。
1.4目的片段的回收和克隆
1.4.1目的片段的回收和克隆所需试剂