土壤pH对活血丹生长及其药材品质的影响(4)
（4）蛋白质含量测定 考马斯亮蓝法。取活血丹叶片0.5 g，于预冷研钵中加2 mL 蒸馏水研磨，4000 rmp离心20 min，上清液即为提取液。取上清液0.1 mL于离心管中，加入5 mL考马斯亮蓝G-250充分混匀，放置2 min后以蒸馏水代替提取液为对照，在595 nm波长下测定，根据标曲算得样品蛋白质含量。
标准曲线的制备 取6支10 mL干净具塞试管（编号为1、2、3、4、5、6），依次加入100 ug•mL-1标准蛋白溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，蒸馏水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.0 mL，再加入考马斯亮蓝G-250试剂5.0 mL，加塞混匀后，放置2 min ，在595 nm 波长测定吸光值，以标准蛋白质含量（ug）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程Y=0.0066x+0.0255，R2=0.9988（n=3）。
（5）过氧化物酶（POD）活性测定 愈创木酚法。取混合液（0.2mol•L-1 pH 6.0磷酸缓冲液50 mL加30% H2O2 0.028 mL加愈创木酚0.019 mL 混合均匀）3 mL加酶液0.1 mL于470 nm波长下测定吸光值，以煮沸的酶液作为对照，每30 s测定一次，测3 min。
（6）超氧化物歧化酶（SOD）活性测定 靛蓝四唑（NBT）法。称取活血丹叶片0.5 g，于预冷研钵中加5 mL pH 7.8的50 mmol•L-1 磷酸缓冲液，冰浴研磨，4000 rmp离心10 min，上清液即为酶提取液。取10 mL离心管，加入酶液0.05 mL后再加入0.05 mol•L-1磷酸缓冲液1.5 mL、130 mmol•L-1 Met溶液0.3 mL、750 umol•L-1 NBT 溶液0.3 mL、100 umol•L-1 EDTA-Na2溶液0.3 mL、20 umol•L-1 核黄素0.3 mL、蒸馏水0.25 mL，以磷酸缓冲液代替酶液为对照组。混匀后将对照管置暗处，其他各管于4000 Lx 日光下反应20 min，反应结束后，以不照光的对照管做空白，在560 nm下测定吸光值。
（7）过氧化氢酶活性测定 高锰酸钾滴定法。称取活血丹叶片0.2 g，于预冷研钵中加3 mL pH 7.8的50 mmol•L-1 磷酸缓冲液，冰浴研磨，4000 rmp离心10 min，上清液即为酶提取液；取0.5 mL酶液，加入4 mL 0.05 mol•L-1 pH 7.0磷酸缓冲液在30℃水浴10 min，以煮沸的酶液为对照；水浴处理后的混合液加入1 mL 50 mmol•L-1 H2O2 反应1 min；再加入2 mL 10% H2SO4 终止反应后用10 mmol•L-1 KMnO4滴定为粉红色。
（8）丙二醛（MDA）含量测定 分光光度法。称取活血丹叶片0.5 g，于预冷研钵中加5% TCA，冰浴研磨，3000 rmp离心10 min，上清液即为提取液;取上清液2 mL，加0.67%硫代巴比妥酸（TBA）2 mL，混合后在100℃水浴上煮沸30 min，冷却后在3000 r•min-1下离心10 min，分别测定上清液在450 nm、532 nm和600 nm处的吸光度值。
1．3．3 活血丹活性成分含量测定
（1）总黄酮含量测定 分光光度法[23]。精密称取活血丹干燥粉末0.1 g于10 mL离心管中，加入6 mL 60%乙醇溶液，超声提取80 min，取出静置使冷却至室温，过滤，取滤液1 mL于25 mL容量瓶中加入8 mL 1.5% AlCl3溶液和4 mL pH5.5的NaAc-HAc缓冲液后用60%乙醇定容，以60%乙醇溶液为空白对照，于420 nm波长下测定。
标准曲线的制备 精密量取芦丁对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6 mL于25 mL容量瓶中，加入8 mL 1.5% AlCl3溶液和4 mL pH 5.5的NaAc-HAc缓冲液，并用60%乙醇水溶液定容至刻度，摇匀，静置0.5 h。以60%乙醇溶液为空白对照，于420 nm下进行扫描，并对吸光值和芦丁含量进行回归处理，得到回归方程Y=24.077x+0.0038，R2=0.9996（n=3）。
（2）醇溶性浸出物含量测定 取活血丹样品粉末2 g于100 mL锥形瓶中，加入55%乙醇50 mL，密塞，称定重量，静置1 h后，连接回流冷凝管，加热至沸腾，并保持微沸1 h。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用55%乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取滤液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105°C干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量。