利用VIGS方法分析TaJRL29的抗赤霉病功能(2)
植物凝集素是一类非酶和非免疫起源的糖特异结合蛋白[3]，能与多糖结合或使细胞凝集，广泛存在于小麦、大豆（Glycine max [Linn.] Merr.）、花生（Arachis hypogaea Linn.）等植物中并在植物防御反应中起着重要作用，能抑制多种病原菌的菌丝生长和孢子萌发。先前已发现，水稻(Oryza sativa)胚中存在的凝集素能使稻瘟病病菌孢子凝集成团，甚至破裂[21]。目前，根据其蛋白结构特点，将已发现的1000多种植物凝集素划分为16个家族[4]。Jacalin类凝集素(jacalin-related lectins，JRLs)是近年来发现的一个植物凝集素超家族的新家族。根据生物信息学分析，很多植物中都发现了JRLs，如水稻[4]，拟南芥(Arabidopsis thaliana)[5]，小麦[6]等。Xiang等[7]克隆了TaJRL1基因，并发现其通过影响茉莉酸（jasmonic acid，JA）和水杨酸（Salicylic acid，SA）信号途径来参与小麦抗病反应。从水葫芦(Eichhornia crassipes)中克隆到的一个Jacalin相关基因EcJRL-1可提高对低硫条件的耐受力[8]。Xing等[9]证明VER2是小麦春化诱导必须的一个JRL基因。由此可见，JRLs在植物的抗病、抗逆等反应及生长发育中具有重要作用。
病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技术是一种由RNA介导的、通过病毒载体携带一段靶基因序列侵染植物，使得同源基因沉默与表型变异，从而快速分析基因功能的反向遗传学方法。外源基因的导入，会使得植物体内与之同源性极高的內源基因的转录受阻，从而导致基因沉默，这是一种转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）现象，最早发现于植物中[22, 23]。随后发现，真菌和动物中均存在此现象，分别称基因消除（quelling）[24]和RNA干涉（RNA interference，RNAi）[25]。目前，植物中特异性地沉默或敲除靶基因的表达的PTGS方法已有多种，病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）就是其中之一[26]。VIGS是由Kammen等[27]最先提出，用于描述寄主植物受病毒侵染后具有恢复正常的能力，其机理与RNAi的机制有很多相似之处。当携带有靶基因片段的病毒载体侵染植物后，由于病毒自身的复制机制所致，通常会首先形成双链RNA（Double stranded RNA，dsRNA）；dsRNA在细胞中被与RAaseⅢ家族相似的特异性核酸内切酶（Dicer酶）切割成21~24nt的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）；siRNAs在植物细胞内通过依赖RNA的RNA聚合酶1（RNA-dependent RNA polymerase 1，RDR1）、RDR2或RDR6进一步扩增，并以单链形式与Agronaute1（AGO1）蛋白等结合形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），RISC特异地与细胞质中的同源mRNA互作，使同源mRNA降解，从而发生PTGS；此外，RISC可被引导到细胞核，导致核内的同源DNA甲基化等，从而影响基因表达，发生转录水平的基因沉默（Transcriptional gene silencing，TGS）[28-30]。与传统的基因敲除、转基因等方法相比，VIGS具有短周期、低成本、高通量等优势[10]。目前，VIGS已经成功应用于50多个物种[11]的相关基因功能鉴定，并有望在未来扩大其应用范围。
本研究以BSMV为VIGS载体，从望水白中克隆得到TaJRL29特异表达的cDNA片段，插入BSMV-γ载体的多克隆酶切位点PacI和NotI上，体外转录后涂抹到孕穗期望水旗叶叶鞘，实施基因沉默。之后接种赤霉菌，进行赤霉病抗性鉴定，以分析的TaJRL29对赤霉病的抗病功能。
1 材料与方法
1．1 试验材料
1．1．1 植物材料 本研究使用材料为抗赤霉病品种望水白（WSB）。WSB种子在实验室发苗后移栽与12×6格穴盘中于培养室种植2周后移至4℃春化室春化3周。春化完成后移入花盆在温室（南京农业大学牌楼试验基地）进行常规栽培。