pPopctrl质粒中Tn5转座子的插入对lux box启动的影响(8)
按照这一方法，本文研究了突变型个体随时间产生并逐渐蔓延的趋势（图3-2）。
从过去已做的实验数据中可知，6 h时细菌已经开始自杀；而通过图3-2可见，对于1、0.1、0.08 mmol/L IPTG的3个试管，突变型个体在9h时才被筛选出来；而对于0.05 mmol/L的试管，则到12 h才有突变型出现。突变型个体的蔓延也与IPTG浓度密切相关。IPTG浓度越大，突变型个体蔓延得越快，伴随着野生型个体的大量自杀，突变型将迅速统治整个种群。
这一结果暗示：如果采用连续培养模式，利用6 h~9 h之间的窗口期，就有可能实现菌群密度的连续振荡而不被突变型个体所破坏。另一方面，如果将以IPTG浓度为参数的选择压力控制在一个合适水平，有可能实现野生型和突变型和平共存的稳态的群落结构。
图3-1通过生长曲线的形状鉴别突变型个体在菌群中的比例（其中图号画圈的表示突变型个体的生长曲线）
Fig.3-1 Discrimination of the mutant from the wild type through the shape of growth curves.
Note：Within these 30 clones, the mutants were marked through the circled number of their curves.
图3-2 不同IPTG条件下突变型个体随时间产生和蔓延的趋势
Fig.3-2 Tendency of the mutant ratios in different IPTG tubes with time.
3.2. 质粒基因测序寻找变异位点
从IPTG为0.1 mmol/L的试管所涂布的12 h，14 h和24 h的平板上已经鉴定为突变型的菌落中，分别随机挑选2个，共6个菌落，于LB培养基中扩大后提取质粒，电泳验证后送测序。结果表明：6个质粒中有3个序列完全相同，因此可以归并为4种质粒，代表着4种突变个体，将其分别命名为1227、1408、2407和2412。
这些突变质粒上都有外部片段插入，并且插入位点基本一致，都在luxR基因第565~577位核苷酸之间。插入片段长度为505~628 bp不等。把插入片段序列在Genebank中Blast发现：这些片段与大肠杆菌IS家族转座酶基因（IS family transposase gene）高度相似（≥99%），意着这是一段转座子。上述4个质粒中，1227的插入片段还破坏了664~844bp之间的原有序列，其余3个质粒都是在一个位点很整齐地插入，且插入位点两侧有重复序列，这符合转座子插入的一般特征。图3-3展示了luxR-luxI基因的结构及以1227为例的外源片段插入。
对这些质粒而言，外源片段的插入直接破坏了luxR基因的完整性。突变型个体可能正是借此脱离了群体感应并进而逃避自杀的。因为所有的序列结果表明：除了这一区域外源片段的插入，质粒上其他区域的序列没有变化。
图3-3 突变型菌株1227的质粒上外源片段的插入
Fig.3-3 Insertion of a fragment intervening the luxR gene of plasmid in the mutant 1227.
3.3. 转座子的插入足以使突变型避免自杀
为了证明质粒上发生的上述插入突变是否足以使细菌逃脱自杀基因回路控制，以及确定是否突变型个体的染色体上也发生了相关突变，我们以不含有任何质粒的野生型top10F’为宿主，将1408和2412两个突变株的质粒分别转化进去，本文将之命名为1408’和2412’。这样的两株菌的染色体与野生型一样，而只有质粒发生了转座子插入。它们在含有1 mmol/L IPTG的TBK培养基中的生长曲线如图3-4所示。
结果显示：与野生型细菌明显的自杀行为不同，1408’和2412’对IPTG均不敏感，没有自杀现象发生，其生长曲线与1408和2412没有显著差异。这说明：突变型个体摆脱群体感应、逃避自杀回路控制是由于外源片段插入luxR基因造成的。
图3-4 野生型、突变型和只有质粒突变的准野生型的生长曲线比较
Fig.3-4 Growth curves of the wild type, mutants and the top10F’ with mutated plasmid in 1 mmol/L-IPTG TBK media.
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