pPopctrl质粒中Tn5转座子的插入对lux box启动的影响(9)
结果显示：与野生型细菌明显的自杀行为不同，1408’和2412’对IPTG均不敏感，没有自杀现象发生，其生长曲线与1408和2412没有显著差异。这说明：突变型个体摆脱群体感应、逃避自杀回路控制是由于外源片段插入luxR基因造成的。
3.4. 抽提质粒
为了探究突变的luxR基因在自杀回路中工作的具体机制，实验中准备构建两个新的质粒，分别以野生型和突变型2412为改造对象，将其中的CcdB基因用GFPuv2代替。新质粒的构建的前提是获得正确的载体质粒和目标基因。而载体质粒是从原始质粒上酶切所得。本次所拼接的质粒所需片段如下表所示：
表3-1 实验中所用生物元件
基因部件 描述 长度
GFPuv2 编码表达GFP蛋白，借助仪器可观察到绿色荧光 878bp
长片段1 以pPopctrl质粒为原质粒，去除CcdB基因 3719bp
长片段2 以突变型2412质粒为原质粒，去除CcdB基因 4613bp
长片段1和长片段2依次在AatII酶的作用下，发生酶切反应，切下长片段。再通过割胶回收，获得目标片段。野生型质粒和2412的质粒验证如下图所示：
图3-1 原始质粒电泳验证图
Fig. 3-1 The electrophoresis of plasmid of wide type and mutant type 2412
从电泳图上可知，野生型质粒和突变型2412均出现一条清晰条带。野生型质粒为4727bp，突变型2412为5621bp。通过Marker可知，该两条条带为目标条带。
3.5. PCR产物
GFPuv2基因来源于117菌株的质粒，我们通过体外扩增的方法来获得目的基因。经过讨论，确定PCR反应条件为：94℃5分钟，94℃30秒，52℃45秒，72℃1分钟（30次循环），72℃7分钟，4度保存。
引物设计：
引物设计同样考虑到标准化部件的设计需要，在基因序列的两端分别添加两个酶切位点。同时，在每个酶切位点前添加一个保护序列。
引物信息见表3-2如下：
表3-2 实验中所用生物元件
Primer名称 序列(5'to3') 碱基数
gfp2841r ccatccagtttactttgcag 20
gfp870f attgacgtcaagcttttatttgtagagc 20
att是保护序列，gacgtc是AatII位点，从c开始是模板的870-851段互补序列，再后面aagctt是HindIII位点。
根据设计好的引物和PCR体系，克隆GFPuv2基因，琼脂糖电泳结果如图3-2所示：
图3-2 GFPuv2基因电泳验证图
Fig. 3-2 The electrophoresis of PCR product
从琼脂糖电泳图中可知：在1000bp左右得到一个亮带，与目标片段的大小相一致。
3.6. 酶切质粒和PCR产物
正如前文所述，长片段1、长片段2分别是以野生型和突变型2412原始质粒为载体，在AatII酶作用下，发生酶切反应所得。通过反复尝试，将酶切反应时间定为2小时。酶切结果如下图3-3所示：
图3-3 WT、2412酶切2小时电泳验证图
Fig. 3-3 The electrophoresis of Enzyme digestion product
从电泳图中可知：在5000bp左右出现清晰明亮条带，在1000bp左右出现较暗的条带。经过核对，明亮的条带出现的位置符合野生型和突变型原始质粒去除CcdB基因后的线性质粒的大小，与目标片段大小一致。
同样，由于在引物设计时，给GFPuv2一端加上了AatII酶切位点。因此，可以利用AatII酶来切除引物。多次尝试后，确定酶切反应时间为2小时。酶切产物电泳验证如下图3-4所示：
图3-4 PCR产物酶切2小时电泳验证图
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