木霉1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶（ACCD）的分离纯化及功能(2)
众所周知，在非生物胁迫条件下植物会产生过量的乙烯，导致根系生长受到抑制，进一步抑制了植物的生长，使植物的系统抗病性降低[3]。生防菌木霉的ACCD酶能够切断植物激素乙烯的前体ACC产生酮戊二酸和氨，降低植物乙烯含量，进而促进植物生长，提高植物的抗病性。因此，ACCD在生物防治中具有广泛的应用前景[4]。
本实验采用硫酸铵分级沉淀技术[5]，在最适硫酸铵饱合度下收集ACCD酶，SDS-PAGE胶分析ACCD酶的纯度，然后将分离纯化到的ACCD酶用来处理大豆植株，分别在15d，30d，60d观察在不同浓度的ACCD酶的条件下，植株的生长情况以及抗病情况。从而了解ACCD酶作用于大豆的最佳浓度。在此基础上观察了解ACCD酶的作用及功能。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试大豆，由周口师范学院生命科学与农学学院提供。木酶由本实验室分离保存，将保存的木霉菌株进行活化，分离、提纯以得到ACCD酶。
培养基：SM无铵培养基和SM培养基。
药品：甲苯；二硝基苯肼；0.56N Hcl；0.2N Hcl；0.2N NaoH；ACC；30%过氧化氢；KH2PO4溶液；磷酸缓冲液； 30％Acr（Acr/Bis）；10％的SDS溶液；10％的过硫酸铵溶液；四甲基乙二胺（TEMED）；1.5M Tris（PH8.8）；1.0M Tris（PH6.8）；0.2M Tris (PH6.8)；1%SDS；30%甘油；巯基乙醇；溴酚兰；0.15％考马斯亮蓝R250溶于脱色液中（脱色液：50％的甲醇，7％的冰醋酸的水溶液）。
1.2 试验设置与处理
1.2.1采用硫酸铵分级沉淀技术分离出木霉的ACCD酶：将实验室保存的木霉菌株进行活化，代谢物过滤后采用硫酸铵分级沉淀法，在最适硫酸铵饱合度下收集ACCD酶，SDS-PAGE胶分析ACCD酶的纯度，并将该酶切胶回收。
1.2.2 ACCD酶处理大豆四个真叶的幼苗：将分离纯化到的ACCD酶处理大豆植株，组培苗生根之前用不同浓度的ACCD酶处理，15d，30d，60d分别统计根的伸长情况，通过测定根长、株高、茎粗、干重和湿重，以及POD、SOD等抗性指标分析ACCD酶促进大豆生长情况以及提高系统抗性情况。
1.3 仪器和设备
TG16台式高速离心机：湖南仪器仪表总厂离心机厂；
AL204电子天平：梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司；
SW-CJ-2FD洁净工作台：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；
LDZX-40KBS型立式电热压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；
HH-S型水浴锅：巩义市英峪予华仪器厂；
Spectrumlab22PC分光光度计：上海棱光技术有限公司；
HPX-9162 MBE 数显不锈钢电热培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备。
1.4 ACCD酶的分离纯化
1.4.1 活化木酶菌株
从4℃冰箱中取出保存的木酶，接种在SM培养基中，在28℃的恒温摇床中培养48小时备用。
1.4.2 收集菌丝
将培养48小时的木酶菌的菌丝在超净台中冲洗，然后接入到SM无铵培养基中备用。
1.4.3 ACCD酶的诱导分离和纯化
在之前得到的含有木酶菌丝的培养基中分别加入0.0005g/ml、0.001g/ml、0.0015g/ml、0.002g/ml、0.0025g/ml、0.003g/ml的ACC，诱导培养的最后阶段。培养物重悬于1/2体积的Tris缓冲液中（0.1M PH=8.5），并匀浆。
25μL甲苯加入到200μL试剂中，充分漩涡30s，加入20μL ACC（0.5M），30℃温浴15min，加入1ml 0.56N的HCL，裂解物离心10000g 10min，取1ml上清液用800μL 0.56N的HCL混匀，加入300μL的二硝基苯肼，加入2ml 2N的NaoH后，30℃温浴30min，然后在A540nm处测出OD值。
然后用SDS-PAGE胶分析ACCD酶的纯度，用两块电泳玻璃板制成垂直板槽（不能漏胶），垂直放置。将配制好的分离胶溶液，倒入，滴加入无离子水，待凝胶聚集后，倒出无离子水，用吸水纸吸干，倒入浓缩胶，再插入梳子。然后分别取样品2ml于离心管中，按1/2比例加入10ml缓冲液，再沸水浴中加热5min，取出待用。用微量注射器分别吸取不超过30ul不同浓度的标准蛋白样品和试验样品注入样品槽。点样结束后，调节电泳仪电流到10mA（2-3mA/em），保持电流稳定不变，当溴酚蓝迁移到离分离胶底1-2cm时，即可停止电泳。电泳完毕后，取出凝胶板，浸入染色液中，在37℃温箱中保温过夜。倒掉染色液，24h后，即可看到清晰的蛋白质条带。
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