1。3。2  RNA逆转录与定量PCR

1。3。2。1 逆转录反应体系与程序（10）

1。3。2。1。1 去除RNA中的DNA：

组分                                    体积

5xgDNA Eraser Buffer                     2µL

gDNA Eraser                             1µL

Total RNA                               2µg

Rnase Free dH20                         补足至10µL

表1 去除RNA中DNA的反应体系

反应程序：

42℃                                    2min

4℃                                      ∞

表2 去除DNA的反应程序

1。3。2。1。2 RNA逆转录

在冰上预先配置如下缓冲液，需要按照样品数+1 的量进行，然后依次分装到上述去除DNA完成后的体系中，轻轻混匀，立即进行逆转录反应（20µL）；

组分                                   体积

上述反应的反应液                        10µL

PrimeScript RT Enzyme Mix I               1。0µL

RT Primer Mix *4                         1。0µL 

5×PrimeScript Buffer 2 for Real Time         4。0µL 

RNase Free dH 2 O                        4。0µL

逆转录酶(M-MLV) (Invitrogen)              1µL

表3 RNA 逆转录反应体系

反应程序

37℃                                37min

70℃                                5min

4℃                                 ∞

表4 RNA逆转录反应程序

1。3。2。2 定量PCR（实时PCR反应体系：20μL）

组分                                 体积

SYBR Premix Ex Taq                    10µL ROX Reference Dye                     0。4µL Primer F/R                        0。4µL 

cDNA                                 2µL 

ddH2O                                6。8µL

表5 定量PCR反应体系

注：每个样品上样三个孔，需配备3。5个孔的反应液，起体积为70µL。注：反应液需要充分震荡。

实时PCR反应程序

95℃预变性35sec；进入循环95℃ 5sec，60摄氏度 34sec。循环数，溶解曲线，标准曲线以及个样品的Ct值均由仪器自动给出。