1。4   大肠杆菌JM109感受态的制作及转化

1。4。1   大肠杆菌感受态的制作（Inoue法）

1)将-70℃甘油菌取出，划线至未添加任何抗生素的LB平板上，37℃培养16-20h后挑取2-3mm单菌落，接种单菌落于2mL LB（添加2M MgSO4，MgSO4终浓度为20mM）培养液中，37℃，220rpm摇菌8-10h，时间不宜过长。文献综述

2)扩大培养，1：50或者1：100接种于100mL LB液体培养基上，此步骤中三角瓶中的培养基不宜过多，以免导致缺氧。18-20℃振荡摇菌12小时，并及时测定OD值，固定在OD600=0。4~0。6。

3)当菌液达到目的OD值后，立即静置冰浴10min；菌液用天平平衡分装入50mL离心管内，4℃以1500rpm离心5-10min，弃上清。

4)轻轻色在预冷Inoue溶液中悬浮细胞，冰上放置15-30min，4℃，1500rpm离心5-10min，弃上清。

5)加入总体积为12mL（0。9mL DMSO，11。1mL Inoue溶液）缓冲液轻轻悬浮细胞，分装至插在冰上遇冷的1。5mL的EP中，每管50~200μL，液氮速冻，-70℃保存。

1。4。2   大肠杆菌的转化

1)从超低温冰箱中取出大肠杆菌感受态（在 EP 管中保存），放置于冰上，将准备好的目的质粒加入融化后的感受态细胞中，轻轻混匀，冰置 30 min；

2)将冰置后的装有混合物的 EP 管在 42 ℃水浴锅中热击 90 s，取出后再次冰置3-5 min；

3)在超净台中加入无抗生素的 LB 培养基 1 mL 与 EP 管中，在 37 ℃，220 rpm的要床上扩培 1 h；

4)在常温离心机中，4000 rpm，离心 1 min；

5)在超净台中弃去上清，利用适量无菌水悬浮，然后在加入对应抗性的 LB 平板培养基上，用涂布棒涂匀，晾干。在 37 ℃培养箱中培养。

1。5  试验用菌株的培养和保存

大豆疫霉全基因组测序菌株 P6497 为美国 Virginia 生物信息研究所 Brett M。 Tyler教授所赠，由本实验室培养和保存。转接：从新鲜的菌落边缘切取大约 5 x 5 mm 的菌丝块转入新的 10% V8 培养基上，在 25 ℃ 黑暗条件下培养 3 d。保存：将菌株转接与固体 10% V8 培养基斜面上，在 10℃条件下保存。

辣椒疫霉菌株为本实验室分离并保存。所有转移和保存辣椒疫霉的方法严格按照标准程序处理。

实验用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株 GV3101，构建载体大肠杆菌（Escherichia coli）菌株 JM109 

1。6  辣椒疫霉的接种方法

1)取 10 ℃条件下保存在斜面培养基的辣椒疫霉转接到新鲜的V8 固体培养基平

板上，25 ℃ 黑暗条件下培养3 d；

2)选取需要接种的叶片，放在准备好的接中盘中，背面朝上，保湿；

3)用打孔器在培养辣椒疫霉的V8 平板上打取直径 5 mm 的菌饼，用灭菌的镊子

将其放置于叶片上，注意不要将其放于叶脉上，然后利用移液器在每个菌饼与叶片的

接触面加 2-3 µL 的无菌水使菌饼紧密吸附在叶片上；来;自]优Y尔E论L文W网www.youerw.com +QQ752018766-

4)利用保鲜膜将接中盘密封，25 ℃ 黑暗条件下培养 36 h，在紫外灯照射下观察记录侵染病斑的大小。

2  结果与讨论

2。1   OG5_154821 外泌家族基因的克隆

在针对目标蛋白基因的复制的过程中，部分基因含有内含子，在转录之后的修饰过程中会被剪切，因此在，在实验中，我们利用大豆疫霉 P6497 菌株野生型的 cDNA 作为模板，对其进行了基因克隆。结果共克隆到8个基因，其中3个不含有信号肽（Ps_128700，Ps_132281， Ps_136030），4个含有信号肽（Ps_135625，Ps_131628，Ps_135493，Ps_135475）。另外 Ps_128701 在现有数据中不含有信号肽，然而利用 SignalP 3。0 再次对其氨基酸序列进行预测时发现，其可能含有信号肽。