人口老龄化是现今世界面临的重要社会问题之一，部分发达国家的人均年龄在未来可能超过八十岁并且还有可能继续向上增长[1]。而我国是世界人口老龄化程度较高的国家之一，同时中国与许多欧美发达国家一样，现今老年病已开始袭向青壮年人群，肥胖、冠心病尤为突出。虽然现代医学使人类的寿命大幅度延长，并且针对衰老及衰老相关疾病已采取多种防治手段，但衰老相关疾病在世界范围内仍然具有较高的发病率、病死率以及伤残率，给个人、家庭、社会造成十分严重的负担，其中又以心脑血管疾病造成的危害最为突出。因此，延缓生命体衰老已经成为当今医学界刻不容缓的研究课题，并且深入探讨相关调节因子在心脏老化进程中所扮演的角色意义重大。

蛋氨酸（methionine，Met）作为一种生物体生长发育的必需氨基酸，机体自身不能合成，依赖于食物供给，其摄入水平对生物体功能可产生广泛影响。近年来，关于饮食蛋氨酸限制对健康和长寿益处的研究时有报道。研究显示，在不影响每日能量摄入的情况下，去除喂养饲料中的胱氨酸和半胱氨酸，同时将蛋氨酸浓度从对照组的正常浓度（0。85% w/w）降为低浓度（0。17% w/w），雄性 Fischer 344 大鼠的寿命延长了30%[2]。在线虫、酵母、果蝇和小鼠等多种试验模型中均验证了蛋氨酸限制可延长寿命[3]。虽然蛋氨酸延长寿命的现象不断被发现，但蛋氨酸限制延长寿命的机制目前尚不清楚。

自噬(autophagy)是细胞的一个重要过程，其通过运用溶酶体和自噬体两个体系来参与细胞的代谢分解，通过能量和物质循环利用维持机体内环境稳态，是能量和蛋白质限制延缓生命体衰老的作用机制之一。相关小鼠实验中发现蛋氨酸和代谢产物水平异常升高时肝脏的自噬能力下降，而膳食蛋氨酸限制可使小鼠肝脏自噬能力恢复到正常状态[4]。许多实验均表明蛋氨酸水平可影响细胞的自噬能力，然而，目前对于蛋氨酸影响自噬的相关机制尚无明确定论。细胞自噬过程可受多种因素的调控，转录因子EB( Transcription factor EB，TFEB) 一直被认为在溶酶体的生物合成中发挥调控作用，而近年来Settembre 等［5］发现TFEB通过转录调控细胞自噬体和溶酶体生成、自噬体与溶酶体融合等过程的关键因子来影响自噬的发生。TFEB作用的靶基因包括自噬相关基因如Beclin 1、LC3B、SQSTM1、UVRAG和WIPI1等，和溶酶体相关基因如v-ATPase、CTSA、CTSB、LAMP1等[6，7]。目前为止，来自优W尔Y论W文C网WWw.YoueRw.com 加QQ7520,18766 蛋氨酸限制饮食是否是通过TFEB影响心肌组织自噬仍未阐明，但前期与本实验相关的研究中之前发现肝脏组织中TFEB在蛋氨酸诱导自噬中发挥重要作用。

成熟的心肌细胞作为一种终末分化的细胞，其清除有害物质主要依赖于其自身的清除降解机制比如自噬，所以心肌细胞的自噬作用对于保持心脏的活力和功能具有重要作用。相关研究表明，心脏在衰老过程中的生理功能出现紊乱、抵抗氧化应激损伤能力下降与心肌自噬能力降低存在一定联系[8,9]，一定水平的心肌组织自噬能力对保护心血管形态和维持心血管功能具有重要作用[10]。多项研究均显示，心脏衰老过程与心肌细胞的自噬能力存在密不可分的联系，心肌自噬功能降低，心脏抗衰老作用减弱。但是TFEB在蛋氨酸限制中的调节自噬作用尚不明确，因此，本研究中采用心肌组织，通过提取mRNA、逆转录、定量PCR，研究蛋氨酸限制对心肌组织转录因子TFEB靶基因的影响，为心脏衰老机制提供理论依据。

2 材料与方法

2。1主要试剂

TRNzol-A+ 总RNA提取试剂（Cat#DP421 100ml Lot#P4511，Invitrogen 公司生产，美国）、氯仿（上海沃凯生物技术有限公司）、异丙醇(上海沃凯生物技术有限公司)、DEPC水（生工生物工程股份有限公司）、引物（为生工生物工程股份有限公司生产，中国上海）、FastQuant cDNA第一链合成试剂盒（TIANGEN）、SuperReal 荧光定量预混试剂盒（TIANGEN）