2。2主要仪器

洁净工作台,常温和低温高速离心机,匀浆仪、海尔冰箱、核酸蛋白测定仪(基因有限公司)、梯度热循环仪(LongGen)、96孔照明板器(美国Thermo scientific)、PCR测定仪(美国Thermo scientific)、刀片、小镊子、EP管架

2。3方法

2。3。1 组织来源论文网

6-8周龄C57BL/6小鼠(饲养于杭州师范大学动物房)分为两组:正常饲料喂养组8只,给予正常浓度饲料饲料(南通特洛菲饲料科技有限公司,TP0035S);蛋氨酸限制组8只,给予80%蛋氨酸限制饲料(南通特洛菲饲料科技有限公司,TP0035)。其中,正常浓度饲料和蛋氨酸限制饲料均为纯化型无胱氨酸饲料,除蛋氨酸含量分别为0。85%(0。85g/100g)和0。17%(0。17g/100g)外,其他成分相同。环境条件:温度控制在23±2摄氏度,湿度50±10%,昼夜循环光照12/12小时,自由进食相应饲料和水,饮水经过高温高压灭菌法处理,每周记录小鼠体重变化。给予实验饲料12周后,处死前禁食12小时,断颈法处死小鼠,收集心脏,做好标记,固定后冰冻切片-70℃冻存用于本实验。

2。3。2 RT-PCR测定心肌组织中TFEB相关靶基因的表达

(一)提取总RNA

本实验中SYBR荧光染料分子来定量检测基因表达产物,实验原理:在形成的整个PCR反应体系中,添加过量的SYBR荧光染料分子后,SYBR这个荧光染料分子会特异性地渗进DNA双链中,这时DNA双链会发射出荧光信号,而在没有渗进SYBR荧光染料的DNA双链由于没有相应染料不会发出任何相关荧光,因此在本实验中,每形成一个DNA双链分子,就会有荧光染料结合发出荧光,并且荧光的强度与DNA双链分子的总数量成正比关系。

利用TRNzol-A+ 总RNA提取试剂操作规范,提取切取的心肌组织中的总RNA。

    ①处理心肌组织:取新鲜的在-70℃冻存的小鼠心脏,用刀片小心切取100 mg心脏组织,然后迅速加入100ulTRNzol-A+,用匀浆仪快速将组织打8-10次碎成匀浆,由于心肌组织较硬,注意等到液体成匀浆之后再加入900ulTRNzol-A+,否则可能会造成组织资源浪费。文献综述

    ②将第一步取得的匀浆样品在冰上静置放置10min,使得心肌匀浆组织中的核酸蛋白复合物完全分离开来。

③两相分离:将匀浆样品中加200ul氯仿,盖好管盖,振荡器旋涡混匀15sec,发现液体混匀之后室温放置5-10min等待分层。 

④将上述分层后的液体轻轻地摆进离心机中,设定4℃ 12,000 rpm并离心5min。缓慢取出后可以发现样品会分成两层:下层黄色的有机相和上层无色的水相,两相之间有一层薄膜隔开,水相上层的体积大约是匀浆时加入TRNzol-A+试剂的60%。需要分离的RNA主要存留在上层水相,把水相(约450ul)分三次,也就是每次150ul转移到新的1。5ul离心管中,每次吸取上层水相时候注意不要触碰到两相之间的白色薄膜,否则会对后续实验测定造成干扰。

    ⑤RNA沉淀过程:实验转移后取得450ul的水相溶液之中混入等体积450ul异丙醇,两者混匀之后在室温下放置10min。

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