1 材料和方法 

1。1 样品采集

从浙江海底采样点1处采集的海泥和学校一些环境采样点2处采集的泥土。

1。2 仪器和试剂

1。2。1 主要仪器   

天平、定时恒温磁力搅拌器、立式压力蒸汽灭菌器、全自动电脑干燥箱、超净工作台、台式恒温振荡器、恒温摇床、Eppendorf移液枪系列（1000μl 、100μl ）、冰箱。                     

1。2。2 主要试剂                               

胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物(Yeast extract)、氯化钠（NaCl）                        琼脂粉。                             

1。3 培养基的配制

Luria-Bertani（LB）液体培养基用于菌株的培养，LB固体培养基用于E。coli的活化、抑菌圈的制作以及菌株的保存。

LB液体培养基：胰蛋白胨2g，酵母提取物1g，NaCl 2g，加蒸馏水定容至200ml。

配制步骤：

(1)按培养基的配方比例依次准确地称取酵母提取物、胰蛋白胨、NaCl放入烧杯中，胰蛋白胨很容易吸潮，在称取时动作要迅速。此外，称药品时严防药品混杂，一把汤匙只能用于一种药品，瓶盖也不要盖错。

(2)在上述烧杯中先加入少量的蒸馏水，再加入一个转子，放在磁力搅拌器上搅拌，待药品完全溶解后，将溶液倒入量筒，此时要小心转子一起倒入250ml量筒中，用蒸馏水冲洗烧杯2-3次，把残留的溶液洗下来，以防药品残留。

(3)然后加蒸馏水，溶液线快到200ml的时候，改为慢慢滴加，直到刻度线上。最后把定容好的溶液转移到蓝瓶中，用报纸包扎好，用记号笔标注培养基的名称、日期，等待灭菌。（LB固体培养基中添加3。6g琼脂粉，用锥形瓶盛装，标注同上。）

1。4 试管、平板和纸片

准备相应数量的试管和平板，用刷子洗刷干净后，用无菌水冲洗一遍，然后放到80度的烘箱里烘干，待烘干后，试管加塞后，每10支试管用报纸包扎好，麻绳捆扎好，平板也用报纸包扎好后，标注日期等待灭菌。文献综述

用剪刀将滤纸剪出一个个的小圆纸片，直径约为60毫米，然后用记号笔标记编号，放入一个干净的平板中，用报纸包扎好后，等待灭菌。

1。5 灭菌

使用前先查看高压蒸汽灭菌锅的水位线是否在高水位，不足的话要加入蒸馏水至线上。

然后将待灭菌的培养基、试管等器皿放进灭菌锅里，关闭锅盖，螺丝要对称拧紧，检查排气阀是否处在开的状态以及安全阀的状态。

打开电源，检查所以的参数设置是否按规定设好，灭菌为121℃、20min，然后按下“Work”键，灭菌锅开始工作。

待温度升至100℃时，关闭排气阀，压力开始上升。

待温度到达121℃时，灭菌开始计时，达到规定的灭菌时间后，等待温度降至80℃以下，再关闭电源，打开排气阀，待压力指针降到0MPa时，方可打开锅盖。

将灭菌后的物品取出，放入烘箱内，烘干后拿出，放好备用。

注意事项 ：

检查密封圈是否正常，如有破损，需及时更换；

待灭菌物品放置不宜过紧，要留有一定的空隙；

灭菌过程正式上压时要预先排净灭菌器内的冷空气；

灭菌结束后，不可立即放气降压，要自然冷却降压；

操作过程中要注意安全，谨防烫伤；

定期更换灭菌器内用水，防止堵塞管道与锈损加热管；