嗜（耐）酸性硫还原菌的分离鉴定及硫还原特性研究(3)
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1．2 实验方法
1．2．1 硫还原菌群的驯化
在从污水处理厂采集到的污泥中加入硫粉和乙酸后，在摇床上培养和驯化硫还原菌群，以硫化氢的产生量和微生物的生物量来表征菌群的富集程度。
使用摇床进行驯化时，转速为180r/min，培养一周之后，将驯化的污泥按10%的接种量接入到新的污泥中，继续驯化培养，与此同时，采用亚甲基蓝显色法测定硫化氢的产生量。重复驯化2-3次之后，硫化氢的产生量相对较高并且相对稳定。
1．2．2 硫还原单菌的分离
参考厌氧菌的培养分离方式来对驯化富集的硫还原菌群进行分离和纯化，并进行功能性验证来比较其单个菌株的硫还原能力的强弱。采用亚甲基蓝显色法来测量硫化氢的产生量以此反映硫还原能力。
将培养驯化好的污泥按照10%的接种量接入到培养基[15]中，调整pH为4，在厌氧状态下进行静置培养。定期测量培养基中的硫化氢的含量和生物量，基本在15-20天左右硫化氢的含量达到平缓期。使用hungate滚管方式进行固体菌落培养，观察菌落生长情况。在厌氧操作箱中挑取相应菌落至液体培养基中富集培养。
1．2．3 硫还原单菌的鉴定
经过多次分离后，在固体平板上获得单一菌落。其在固体平板上的形态特征为规则圆形，颜色透明。将纯菌液进行16sRNA鉴定，并在预处理后进行扫描电镜分析。
预处理方法为：
①菌种在10000r/min情况下离心10min，倒去上清液，在沉淀中加入pH=7的磷酸缓冲液清洗三次后倒入2.5%戊二醛固定液进行细胞固定。
②取固定好的沉淀用蒸馏水清洗三次，之后用不同浓度的酒精进行梯度脱水，酒精浓度设置为：30%、50%、70%、80%、90%。每个梯度静置10min。脱水完毕后再用纯酒精脱水三次，每次30min。然后用纯叔丁醇置换酒精三次，每次30min。
③将细菌-叔丁醇悬浮液混匀，然后滴在覆有盖玻片的样品台上，放置在-10℃预冷的冷冻干燥机内进行冷冻干燥。
④将冷冻干燥好的菌体，喷金，进行电镜扫描观测、拍照。
菌株的16sRNA序列分析
将具有较强脱色能力的菌株用不加染料的富集培养液扩大培养后，用柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取基因组DNA，然后以其为模板进行PCR扩增。进行电泳检查，切胶纯化测序，最后通过拼接序列分析结果。PCR扩增条件为:
1．2．4 硫还原菌的生理生化实验
①糖（醇）类发酵试验
在糖发酵半固体培养基中添加溴甲酚紫试剂，无菌环境下将NAU-16菌株接种到培养基上，37℃培养1天，观察记录结果。不产酸为阴性，呈紫色；产酸为阳性，呈黄色。
②淀粉水解试验
在NAU-16菌株液体培养物中，滴加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应培养基呈深蓝色；阴性反应则呈深蓝色。
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