磷酸盐吸附蛋白细菌细胞表面展示体系的构建(2)
1.1.2 细胞表面展示概述
细胞表面展示（bacterial cell surface display）通常是指通过DNA重组技术，将某一具有特定功能的外源蛋白的编码基因与受体细菌细胞表面的锚定单元（anchoring motif）的编码基因融合后，通过融合蛋白在受体细胞中表达、分泌以及与细胞表面特定结构成分之间的识别，所表达的融合蛋白最终固着在宿主细胞的表面，以达到研究或应用的目的[1]。其原理是通过把靶蛋白基因序列(外源蛋白)与特定的载体蛋白基因序列(定位序列)融合后导入微生物宿主细胞，使靶蛋白表达并定位于微生物细胞表面。常用的载体蛋白有膜蛋白、附属结构蛋白、粘附蛋白、凝集素以及S-层蛋白等。外源蛋白与载体蛋白序列的融合方法有C末端融合、N末端融合、插入融合。目前开发应用的微生物细胞表面展示系统包括革兰氏阴性细菌表面展示系统、革兰氏阳性细菌表面展示系统和酵母菌表面展示系统[5]。微生物细胞表面展示技术有着广泛的用途，如开发细胞催化剂、活疫苗、细胞吸附剂、生物传感器以及用于医学诊断、工业、环境保护等的细胞受体等。锚定于细胞表面的外源蛋白可以克服某些大分子底物不能直接穿越细胞膜进入胞内反应位置，以及某些反应产物在胞内无法正确折叠等弊端。细胞表面展示的外源蛋白能与细胞外环境中的特定反应底物直接接触并发生作用，从而大大提高反应效率；同时，通过设计简便的胞外制备流程即可提取反应产物，从而免去某些产物通常不得不从细胞内提取与纯化等一系列复杂低效的操作过程。因此，细菌细胞表面展示在细菌表面多肽文库的构建与筛选，抗原在非致病细菌细胞表面表达，环境中有毒物质的降解、口服疫苗、生物传感器等多方面显示出良好的发展潜力[1]。自1986年Freudl等首先报道细菌表面展示技术后，经过20余年的研究和开发，这一技术获得了长足的发展，现已在应用于活体疫苗开发、蛋白质及多肽文库筛选、抗体合成、生物传感器研制、全细胞生物催化剂和生物吸附剂等领域，新的应用途径仍在不断地发掘之中[6]。
1.1.3 细胞表面展示体系概述
细胞表面展示体系通常由运载蛋白(又称锚定单元，carrier protein)、乘客蛋白(passenger protein)和宿主菌三部分组成。细胞表面展示技术是通过一段具有分泌转运功能的蛋白质或多肽与外源蛋白融合表达, 然后将外源蛋白转运并锚定于细胞表面而实现外源蛋白的特定功能[9]。
运载蛋白的功能是将靶蛋白引导并锚定于细胞表面特定部位，因此一般应具有以下特性：①在结构上具有锚定单元，使靶蛋白能固定在细胞表面；②一般具有信号肽或转运信号，藉此引导表达的融合蛋白穿越细胞质膜；③与外源蛋白融合后其本身的锚定特性不发牛改变；④展示的靶蛋白不易被胞内蛋白酶降解[7]。目前已证实多种具有上述特性的细菌细胞蛋白，按其结构部位与功能，可分为细胞膜孔道蛋白、细胞壁相关蛋白、S-层蛋白、细胞表面附属物蛋白和其他类型蛋白等[10]。
靶蛋白是在细胞内合成后经跨膜转运和在细胞表面固定并展现功能的特定蛋白，其活性大小直接决定着展示系统性能的优劣。并非所有内源或外源合成蛋白都适合于用作靶蛋白，一般要求靶蛋白分子内不能形成二硫键或者在发挥活性时需要进行特殊的折叠、靶蛋白一级结构中带电荷的氨基酸不能对融合蛋白在细胞表面的锚定产生干扰、靶蛋白功能活性区域(如酶的活性中心)的位置通常不能太靠近融合位点等[7]。
宿主菌的遗传背景也是影响展示系统性能的关键因素。宿主菌应对异源蛋白具有很好的兼容性和较低的蛋白酶降解活性，同时应具有容易培养或某种有利于展示性能发挥的特性，如恶臭假单胞菌的强抗逆性能。在各种微生物类群中, 目前已经建立起多种表面展示系统,如噬菌体展示系统、革兰氏阳性菌表面展示系统、革兰氏阴性菌表面展示系统、酵母表面展示系统和杆状病毒表面展示系统等。革兰阴性菌是研究较早和目前报道较多的宿主菌[7]。
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