磷酸盐吸附蛋白细菌细胞表面展示体系的构建(6)
2）检查Wash Solution中是否已经加入乙醇。
3）检查Buffer P2和P3是否出现沉淀。
（2）取1.5~5ml 过夜培养的菌液，8000×g离心2 min，收集菌体，弃尽培养基。
（3）在沉淀中加入250ul Buffer P1彻底悬浮菌体。
（4）加入250ul Buffer P2 立即温和颠倒离心管5~10次混匀，室温静置2~4 min。
（5）加入350ul Buffer P3立即温和颠倒离心管5~10次混匀。
12000×g离心5~10分钟，将上清液移入吸附柱，8000×g离心30秒，倒掉收集管中的液体。
（6）(选做)加入500ul Buffer DW1，9000×g离心30秒，倒掉收集管中的液体。
（7）加入500ul Wash Solution，9000×g离心30秒，倒掉收集管中的液体。
（8）重复步骤(7)一次。
（9）空吸附柱于9000×g离心1 min。
（10）将吸附柱放入一个干净的1.5 ml离心管中，在吸附膜中央加入50~100ul Elution Buffer室温静置1 min后，离心1 min，保存管中DNA溶液。
将上述步骤提取出的DNA溶液上样5 ul于0.8%琼脂糖凝胶，电泳验证。
（B）减法提取质粒，步骤如下：
（1）取l.5 mL培养好的新鲜菌液于l.5 mL Eppendorf管中，10,000rpm离心l min，收集菌体。
（2）加入100 uL溶液I，充分悬浮菌体。
（3）加入200uL新配置的，混匀，置冰上反应5 min。
（4）加入150 uL溶液III，冰上反应5 min，12,000 rpm离心5 min，取上清至一干净Eppendorf管中。
（5）加入等体积的溶液IV，混匀，12,000 rpm离心5 min，将上层水相转移至另一干净Eppnedorf管中。
（6）加2倍体积冷无水乙醇，混匀，室温下静置10 min，12,000 rpm离心l0 min，弃上清，干燥后溶于20 uL TEbueffr。
将上述步骤提取出的DNA溶液上样5 ul于0.8%琼脂糖凝胶，电泳验证。
3.2.2 引物设计
表1 PCR反应引物
引物名称
Primer 序列（5’端~3’端）
Sequence(5’~3’)
Phos1 GGAAGATCTGAAGCAAGCCTGACAG
BglII
Phos2 CCGGAATTCTTAGTACAGCGGCTTA
EcoRI
a) 引物中引入的酶切位点用下划线标出
3.2.3 PCR扩增目的基因片段phoS
对磷酸盐吸附蛋白编码基因进行菌落PCR，PCR所加试剂见表2，所用菌为JM109。PCR的反应体系为94℃ 3 min，（94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 45 s） ×30，72℃ 10 min，4℃ ∞。将得到的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳验证。
表2 PCR反应试剂
试剂 Phos扩增/ul 空白对照/ul
10×buffer 2.5 2.5
primer 2×1.0 2×1.0
Mg2＋ 1.5 1.5
dNTP 1.0 1.0
dH2O 17.0 17.5
质粒 0.5 不加
Taq酶 0.5 0.5
3.2.4 PCR产物的连接
表3 PCR产物连接试剂
试剂 用量/ul
pMD-19T 1
phos 1
d2H2O 3
Total 5
恒温16℃放置2h以上或4℃过夜。
3.2.5 转化pMD19T-phos重组菌
转化（transformation）是将一种生物（供体）的遗传物质（通常为DNA）转入另一种生物（受体）并使其在受体中得以保存和繁殖的过程。大肠杆菌不是天然感受菌，在低温（0~5 ℃）环境下经CaCl2处理，细胞壁变松变软后能摄入外源DNA，这种状态称为感受态细胞（competent cell）。经CaCl2处理后大肠杆菌与外源DNA混合进行42 ℃短时间的热激可利于外源DNA转化，然后再经过恢复和筛选，选择转化子。
（1）挑取JM109单菌落接种于液体LB培养基，37℃ 180 r/min振摇培养过夜。
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