原花青素在杂草稻和栽培稻颖果发育过程中的积累(2)
目前国内外关于原花青素研究方法比较多[6]，主要为可见分光光度法，其中又可分为香草醛法、正丁醇盐酸法、对二甲氨基肉桂醛（Dimethylaminocinnamaldehyde，DMACA）法、FeCl 3显色法等。此外还有高效液相色谱法、电化学方法,源^自#优尔^文~论`文]网[www.youerw.com、毛细管电泳法等。每种方法都各有优缺点，其中对二甲氨基肉桂醛（DMACA）法因具有显色方法简便、费用较低等优点，被广泛应用于原花青素含量的测定[7]。其原理如下：在ph＜7的条件下，对二甲氨基肉桂醛 (DMACA)可以和黄烷-3,4-二醇、黄烷-3-醇、原花青素等物质发生显色反应生成蓝色产物，且浓度越大则颜色就越深，并在波长λ=640 nm时拥有最大吸收值[8] 。
为此，本实验以杂草稻WRL-162为供试材料，以普通栽培稻日本晴作为对照，通过对颖果的形态、颜色以及组织结构观察，研究原花青素在杂草稻颖果发育过程中的产生部位以及扩散过程。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 最适DMACA染料浓度
新鲜洋葱取内表皮进行染色观察。原花青素（1% PA）溶液。三种不同浓度DMACA
溶液（1）1% DMACA（12N HCl）：98 ml甲醇，1ml 12N浓盐酸，1g DMACA；（2）0.1% DMACA（12N HCl）：99 ml甲醇，1 ml 12N浓盐酸，0.1g DMACA；（3）1% DMACA（6N HCl）：98 ml甲醇，1ml 6N浓盐酸，1g DMACA。
1.1.2 颖果形态及颜色的观察
栽培稻日本晴日本晴和杂草稻WRL-162自抽穗后每五日上午8～9点进行取样，分别取第0天、5天、10天、15天、20天、25天、30天、35天的小穗各20个，共十六组样品分装保存于-80℃冰箱，用于观察形态及颜色的变化。根据预实验的结果配置最适浓度的DMACA溶液，用于染色并分析原花青素的积累情况。
1.1.3 颖果显微结构的观察
-80℃贮存的杂草稻162和栽培稻日本晴抽穗后第0天、5天、10天、15天、20天、25天、30天、35天的小穗；1% DMACA（6N HCl）溶液。
1.2实验方法
1.2.1 最适DMACA染料浓度
1.2.1.1 在干净的载玻片上滴一滴清水，撕取一小片洋葱鳞片叶内表皮放于水滴中展平,盖片后制成临时切片，在显微镜下观察正常洋葱表皮细胞的形态。
1.2.1.2 撕取一小片洋葱鳞片叶内表皮制成临时切片，分别在盖玻片的一侧滴加原花青素（1% PA）溶液，用吸水纸从盖玻片的另一侧吸引，染色5分钟，在显微镜下观察洋葱表皮细胞直接经原花青素溶液染色后的情况。
1.2.1.3 分别在盖玻片的一侧滴加不同浓度的DMACA溶液，用吸水纸从盖玻片的另一侧吸引，在显微镜下观察洋葱表皮细胞直接用DMACA溶液染色5分钟后的情况。
1.2.1.4 先用原花青素（1% PA）溶液将洋葱表皮细胞进行染色处理5分钟，然后分别用三种不同浓度的DMACA溶液再次染色处理5分钟，在显微镜下观察染色情况，并对三种不同浓度的DMACA溶液的染色效果进行比较，选出最适浓度。
1.2.2 颖果形态及颜色的观察实验方法
1.2.2.1 成熟杂草稻及栽培稻颖果的观察
1.2.2.1.1 直接观察
取成熟的杂草稻162和栽培稻日本晴颖果，剥去谷壳后在解剖镜下观察，拍照记录并进行对比；将成熟的颖果顺着胚的方向横切，在解剖镜下观察截面情况并进行对比。
1.2.2.1.2 染色观察
取成熟的杂草稻162和栽培稻日本晴颖果，剥去谷壳后分装在不同的离心管中，加入适量的1%DMACA（6N HCl）溶液进行染色，在解剖镜下观察，拍照记录并进行对比；同样的方法将横切的成熟颖果进行染色处理，在解剖镜下观察截面情况并进行对比。
1.2.2.2 成熟杂草稻及栽培稻种子萌发三天后的观察
取两个透明塑料培养皿，垫入两层发芽纸，用水充分湿润后，倒去多余的水，每皿分别播入20粒杂草稻162及栽培稻日本晴的成熟种子，常温下培养，萌发3天后观察生长情况，并用1%DMACA（6N HCl）溶液处理观察染色情况。