血管紧张素转化酶2在不同日龄猪肠道中的表达差异(3)
PT1200DL手持式电动组织匀浆机（瑞士宝创（Polytron）公司）；GMBh8 CO.KG Miklro-22R高速低温离心机（德国Andreas Hettich公司）；Q5PCR仪（美国Bio-Rad公司）；核酸浓度测量仪（德国Eppndorf 公司）；BS210S电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）。
1．2 试验动物及样品采集
3日龄雄性仔猪、90日龄雄性生长猪及120日龄雄性成年梅山猪各2头，由江苏禾木农博园有限公司梅花山猪场提供。
致昏后采用心脏放血法处死，并迅速采集十二指肠、空肠（前段、中段和后段各采3份）、回肠等小肠组织各3份。经生理盐水漂洗后超低温保存。
1．3 引物设计与合成
根据GenBank上公布的猪的ACE2和GAPDH的基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计引物（序列见表1），并由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成。
表1 ACE2和GAPDH引物序列
Table 1 the primer sequence of ACE2 and GAPDH
基因 基因库序列号 引物序列（5'-3'） 产物大小/ bp
ACE2 NM_ 001123070.1 GAGAAACCGAGCATAGAT 106
AGGGAGACCAATAGACAC
GAPDH XM_ 007469428.1 CACCAGGGCTGCTTT 203
TGATGTTGGCGGGAT
1．4 肠道各组织总RNA提取和反转录
取约100mg猪小肠各组织，用电动匀浆器彻底匀浆后采用Trizol抽提法提取总RNA。采用紫外比色法测定总RNA的浓度和纯度后使用甲醛变性胶验证其完整性。选取A260/A280在1.8～2.0之间的总RNA，两步法进行反转录，得到cDNA。反转录体系如下：RNA 2μg，RNA酶抑制剂 20U，M-MLV反转录酶 100U，5×RT buffer 5μL，dNTP 0.14mmol/L，随机引物 4μmol/L。
1．5 ACE2的PCR扩增及电泳鉴定
以上述cDNA为模板进行RT-PCR扩增，条件如下：95℃预变性 5min；95℃变性 30s，53℃退火 30s，72℃延伸 1min，共计36个循环。1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增后产物，电压为115V，时间为45min。
1．6 不同日龄仔猪胃肠道各组织ACE2 Real-time PCR定量鉴定
对上述cDNA进一步采用Real Time PCR 荧光染料掺入法（Sybr-Green）进行ACE2的相对定量分析。20μL定量反应体系中，荧光酶SYBR Green 10μL，10pmol/μL基因引物2μL，cDNA模板2μL，灭菌水6μL。以溶解曲线不出现非特异性峰，最高的荧光值和最小的Ct值为标准，分别优化退火温度、循环条件和引物浓度。PCR反应条件为：94℃预变性 5min；95℃变性 30s，60℃退火 30s，72℃延伸 15s，共计40个循环。每个样品做2个重复。循环结束后，绘制溶解曲线，并验证产物纯度。各样本结果均用其相应的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GADPH）标化，用相对定量2-△△CT法进行数据统计。
1．7 统计学分析和处理
使用SPSS 16.0统计软件进行统计分析和处理，差异显著性检验采用独立样本t检验（Student's t Test）和单因素方差分析（One-Way Anova, LSD）。所有试验数据均以平均值±标准误(χ±SE)表示。
2 结果与分析
2．1 不同日龄猪肠道中 ACE2 基因的 RT-PCR
将ACE2基因RT-PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图1、图2和图3所示。结果显示：ACE2基因在3日龄仔猪、90日龄生长猪和120日龄成年猪的各自十二指肠、空肠（含前段、中段及后段）和回肠中均有106 bp左右的清晰条带，因此表明ACE2在这些肠道内均有表达。