微生物复合菌肥对温室黄瓜生长的影响(5)
(3)750umol/L NBT溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100mL，现配现用，低温避光保存，可使用2~3d。
(4)100umol/L EDTA-Na2溶液：称取0.003721mg EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100mL，低温避光保存，可使用8~10d。
(5)20umol/L 的核黄素溶液：称取0.00753g核黄素用磷酸缓冲液定容至100mL，低温避光保存，现配现用。
1.5.3.2 操作步骤
去植物叶片（去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1mL磷酸缓冲液在冰浴下研磨成匀浆，倒入10mL刻度试管中，加缓冲液定容为5mL。取2mL于离心管中在10000r/min的转速下离心15min,上清液即为SOD提取液。
每组样品都取8个洁净干燥的试管编号，按表2加入各试剂，反应系统总体积为3mL。试剂全部加入后混匀，将1号置于暗处，其余各杯均与25℃、4000lx日光灯下反应20min,各管受光情况要一致，然后立即遮光停止反应。
表3 各杯反应体系加入溶液量
杯号 0.26mol/L
Met(mL) 100umol/L EDTA-Na2(mL) 20umol/L 核黄素(mL) 酶液
(uL) 蒸馏水(mL)
1 0.3 0.3 0.3 0 1.8
2 0.3 0.3 0.3 0 1.8
3 0.3 0.3 0.3 0 1.8
4 0.3 0.3 0.3 5 1.795
5 0.3 0.3 0.3 10 1.79
6 0.3 0.3 0.3 15 1.785
7 0.3 0.3 0.3 20 1.78
8 0.3 0.3 0.3 25 1.775
在560nm波长下，以一号杯调零，测定其余各杯反应体系的吸光度。以2、3号对照杯OD560的平均值（A1)为参比（NBT被100%还原），分别计算不同酶液量抑制NBT光还原的相对百分率。
1.5.3.3 计算结果
NBT光化还原的抑制率（%）=[1-（A1-A2)/A1]×100%
式中：A1---对照杯OD560；A2----加酶杯OD560 。
以酶液用量(uL)为横坐标，以NBT光化还原的抑制率（%）为纵坐标绘制二者相关曲线。从曲线查得NBT光化还原被抑制50%所需的酶液量(uL)，作为一个一个酶活力单位（1U）。
SOD活性(U•min-1•g-1FW）=（V×1000）/(B×W×t)
式中：V-酶提取液总量（mL)，B为一个酶活力单位的酶液量(uL)，W-样品鲜重（g)，t-反应时间(min)。
1.5.4 黄瓜幼苗POD活力测定[9-11]
1.5.4.1 试剂
(1)0.02mol•L-1 KH2PO4溶液：称取0.272g KH2PO4溶解并用蒸馏水定容至100mL。
(2)0.1mol•L-1 pH6.0磷酸缓冲液：称取0.438g Na2HPO4•2H2O和2.737g NaH2PO4•2H2O用蒸馏水定容到1000mL容量瓶中。
(3)反应混合液：取0.1mol•L-1 pH6.0磷酸缓冲液50mL，加入愈创木粉0.028mL，加热搅拌，直至愈创木粉溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢0.019mL，混合均匀，于冰箱中保存。
1.5.4.2 操作步骤
称取1.00g洗净的植物叶片，剪碎后放入以冷冻过的研钵中，加入少量石英砂和0.02mol•L-1 KH2PO4溶液5mL，冰浴研磨成匀浆，于4000r•min-1下离心15min，上清液转入25mL容量瓶中。所剩沉淀再用5mL 0.02mol•L-1 KH2PO4溶液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，保存在冰箱中备用。